【实验目的】

  通过分子杂交检测插入的外源DNA是否确实是所需克隆的目的基因片断。
【实验材料】

  经过完全酶切的基因组DNA；

【试剂与器材】

  HindIII；

  BamHI；

  进口琼脂糖 (agarose)：质量分数为0.8%～1.5%；

  10×TBE缓冲液：108g Tris，55g硼酸，40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至1L。电泳时工作浓度为0.5×TBE缓冲液；

  溴化乙锭(ethidium bromide,EB)：贮存浓度为0.5mg/ml，工作浓度为0.5mg/L；

  6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖，10mmol/L EDTA(pH8.0)，4℃保存；

  核酸标准Marker

  0.25mol/L HCl；

  变性液：0.5mol/L NaOH ，1.5mol/L NaCl；

  中性液：0.5mol/L Tris-HCl（pH7.5），3mol/L NaCl；

  20×SSC溶液：3mol/L NaCl，3mol/L柠檬酸钠，用HCl调pH7.4；

  2×SSC溶液；

  Dig标记和检测试剂盒；

  洗液：0.1mol/L马来酸，0.15mol/L NaCl，用固体NaOH调pH7.5后，再加0.3% Tween 20。

  检测缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl，pH9.5；

  金属自动恒温加热器；超净工作台；微量移液器；常温离心机；冰箱；核酸电泳仪；制冰机；离心管；枪头；核酸电泳槽。硝酸纤维素膜或尼龙膜；烘箱；常温摇床；分子杂交仪；

【实验思考题】

  1.在进行Southern印迹杂交时,DNA酶切反应不彻底会有何影响? DNA发生降解又有何影响?

  2.在进行转膜时应注意什么问题?

  3.怎样防止毛细作用引发的短路?

  4.如何将转移后的DNA固定在膜上?