【实验目的】

  学习质粒的基本性质，掌握最常用的质粒提取的原理与方法，为基因工程提供载体原料。
【实验材料】

  pBSKS质粒菌，pET28(c)质粒菌，pBSKS-ChiA重组质粒菌

【试剂与器材】

  LB液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，用NaOH调pH到7.2，121℃灭菌20min备用。固体LB培养基则在LB液体培养基中添加1.5%～2%琼脂，灭菌后备用；

  氨苄青霉素：母液100mg/ml，工作浓度100ug/ml；         

  溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10mmol/L EDTA；

  溶液II：0.2 mol/L NaOH，1% SDS；

  溶液III：3mol/L醋酸钾用醋酸调到pH 4.8；

  酚/氯仿/异戊醇：V/V=25:24:1；

  NaAc：3mol/L，pH5.2；

  TE：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1mmol/L EDTA；

  无水乙醇；

  70%乙醇；

  RNaseA：10mg/ml。    

  进口琼脂糖 (agarose)：质量分数为0.8%～1.5%；

  10×TBE缓冲液：108g Tris，55g硼酸，40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至1L。电泳时工作浓度为 0.5×TBE缓冲液；

  溴化乙锭(ethidium bromide,EB)：贮存浓度为0.5mg/ml，工作浓度为0.5mg/L；

  6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖，10mmol/L EDTA(pH8.0)，4℃保存；

  λDNA/HindⅢ标准Marker。

  灭菌锅；冰箱；制冰机；旋涡混合仪；微量移液器；超净工作台；常温离心机；水浴锅；核酸电泳仪；紫外分光光度计。

【实验思考题】
  1,质粒的基本性质有哪些?
  2.质粒载体与天然质粒相比有哪些改进?
  3.抽提质粒的基本原理是什么?
  4.在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题?
  5.质粒抽提实验中溶液I、Ⅱ、Ⅲ各有什么作用?
  6.什么是质粒多克隆位点(MCS)?
  7.从溶液中回收DNA时,可以用乙醇或异丙醇进行DNA的沉淀,乙醇或异丙醇沉淀DNA各有什么不同?
  8.用氯仿/异戊醇除去蛋白等作用时,其中异戊醇起什么作用?
  9,克隆质粒与表达质粒有什么异同点?
  10.在进行DNA重组实验中,有一同学试图利用提取染色体DNA的试剂和方法从细菌细胞中提取质粒。利用你现有的知识,请你给他参谋一下,他的这种设想是否可行?如果采用提取染色体DNA的试剂和方法,最后得到的是什么样品?