【实验目的】

  掌握PCR扩增的原理与方法，了解PCR引物及参数的设计。利用PCR扩增的方法获取用于表达的目的基因及Southern杂交的探针。
【实验材料】

  分离纯化的细菌染色体DNA

【试剂与器材】

    10×PCR buffer；

    MgCl2（25mmol/L）；

    dNTP混合液（10mmol/L）；

    Taq DNA聚合酶（5U/ul）；

    引物1（10umol/L）；

    引物2（10umol/L）；

    模板DNA；

    ddH2O。

    0.5×TBE缓冲液；

    6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖，10mmol/L EDTA(pH8.0)；

    λDNA/HindⅢ标准Marker；

    琼脂糖。

    冰箱；制冰机；微量移液器；超净工作台；常温离心机；核酸电泳系统。

 【实验思考题】
  1.降低退火温度、延长变性时间对反应有何影响?            /
  2.PCR循环次数是否越多越好?为什么?
  3.如果出现非特异性条带,可能有哪些原因?
  4,简述PCR扩增技术的原理与各试剂的作用(Mg²⁺、dNTP、引物、DNA、缓冲液)。
  5,给你一基因片段的序列,如何设计PCR引物?PCR引物的要求是什么?
  6,什么是简并引物(degenerate primer)?简并引物设计的一般原则是什么?
  7.什么是嵌套引物?在PCR扩增中有什么优点?
  8.根据实验你觉得PCR扩增中最可能出现什么问题?
  9.影响PCR实验结果的因素有哪些?