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基因工程技能训练

基因组DNA的制备

来源：浙江大学生物学国家级实验教学示范中心

时间：2023-03-23 18:07:28

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【实验目的】
  分离纯化染色体DNA（即基因组DNA）作为PCR扩增模板及Southern杂交分析，也可用于构建基因组文库。
【实验材料】
  G-1菌株
【试剂与器材】
  LB液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，用NaOH调pH到7.2，121℃灭菌20min备用。固体LB培养基则在LB液体培养基中添加1.5%～2%琼脂，灭菌后备用；
  溶液I：50mmol/L glucose，25mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10mmol/L EDTA；
  溶菌酶：100mg/ml；
  蛋白酶K：10mg/ml；
  酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)；
  醋酸钠：3mol/L（pH5.2）；
  无水乙醇；
  70%乙醇；
  RNaseA：2mg/ml；
  TE：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1mmol/L EDTA。
  主要实验试剂的作用：
    EDTA：为Ca2+、Mg2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA在纯化过程中被酶解。
    溶菌酶：可使细胞壁较为温和地破裂，有利于保持核酸结构的完整性。
    蛋白酶K：可去除与DNA紧密结合的蛋白质。
    苯酚:氯仿:异戊醇：苯酚、氯仿可使蛋白质变性，异戊醇为消泡剂。
    乙醇：可沉淀DNA。   
    醋酸钠：用乙醇沉淀DNA时，通常在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+可中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
    RNaseA：去除RNA，由于RNaseA中常含有DNase，而RNaseA具有较高的耐热性，故可采取加热后除去DNase的方法，以防止DNA降解。
  灭菌锅；天平；pH计；冰箱；恒温摇床；超净工作台；试管；离心管；枪头；台式离心机；高速冷冻离心机；微量取液器；制冰机；金属自动恒温加热器；旋涡振荡仪。
 【实验思考题】
  1.如何正确使用微量移液器？
  2.如何准备基因操作中的吸头、Eppendorf管等器具，在使用这些东西时应注意什么？
  3.提取染色体DNA的基本原理是什么?在操作中应注意什么？
  4.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？
  5.进行DNA抽提，为什么用pH 8.0的Tris-HCI水溶液饱和苯酚？显红色的苯酚可否使用？如何保护苯酚不被空气氧化?
  6.在基因工程操作中苯酚、氯仿的作用是什么？
  7.如何检测和保证DNA的质量？