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发育生物学实验

实验十 基因表达的免疫组织化学分析

来源：浙江大学生物学国家级实验教学示范中心

时间：2023-03-23 15:50:31

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一、实验目的：了解掌握免疫组化的实验原理,熟悉免疫组化的实验流程。了解免疫组化在研究基因表达中的作用和意义。
二、免疫组织化学的基本原理：免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指用带显色剂标记的特异性抗体在胚胎组织和细胞中通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的技术。与免疫荧光技术是通过抗体上标记的荧光基团，在荧光显微镜下激发出荧光才能进行观察不同，免疫组化是利用显色剂进行化学显色，在普通显微镜下即可进行观察。在免疫荧光法中样品的荧光强度会随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存；而免疫组化染色的标本可长期保存和观察。
三、实验器材，材料与试剂
1、实验器材：水浴锅；电炉或医用微波炉；湿盒若干（根据任务量选择）；染色缸（玻璃或不锈钢，磨口玻璃缸最好）；切片架（不锈钢或铜制，不锈钢较好）；切片盒；滴管、加样枪、盖玻片、镊子、组化笔；
2、实验材料：检测样品，与检测目标物质进行特异性抗原-抗体反应的一抗、显色用二抗等。请特别注意抗体的特异性、效价和交叉反应，最好用单克隆抗抗。
3、常用试剂:
PBS(磷酸缓冲液), 丙酮, 山羊血清,牛血清白蛋白(BSA), DAB (Diaminobenzidine) 显色剂, 甘油, 0.5M碳酸缓冲液（PH9.5）, 0.02M TBS缓冲液（PH8.2）。
四、镜检标本的制备
待测的胚胎组织样品经冰冻切片或石蜡切片（见实验六，七）而制备用于在普通光学显微镜下进行免疫组化分析的镜检标本。免疫组化标本制备注意事项包括：
1、取材和固定方面：离体组织应尽快的进行取材，最好2小时内,能有效防止组织自溶坏死，抗原丢失。组织固定时间最好在12小时内，一般固定时间不应超过24小时，随着固定时间的延长，对组织抗原的检出强度将逐渐降低。
 2、组织脱水、透明、浸蜡方面：脱水透明要充分，但不能过。正常大小的组织块在无水酒精脱水1小时，重复3次后，二甲苯透明1小时即可。浸蜡时间要够，但温度不能高，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过63℃。
3、切片方面：必须在清洗干净的玻片上进行粘合剂的处理以防脱片。切好的切片在60℃温箱中烘烤，温度不宜过高，否则易使组织细胞结构破坏，抗原标记定位弥漫现象。
四、实验步骤
分别以石蜡切片和冰冻切片为例介绍检测基因表达的免疫组化分析技术。
（一）石蜡切片免疫组化室验流程
1、脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
（1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
（2）盛有无水乙醇的玻璃缸中浸泡5分钟，重复2次；
（3）盛有95%乙醇的玻璃缸中浸泡2分钟；
（4）盛有80%乙醇的玻璃缸中浸泡2分钟；
（5）盛有70%乙醇的玻璃缸中浸泡2分钟；
（6）盛有ddH2O的玻璃缸中浸泡5分钟;
（7) 盛有1×PBS的铁盒中洗3分钟，重复3次。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶
（1）用封闭通透液浸润切片30分钟（室温避光）；
（2）盛有1×PBS的铁盒中洗3分钟，重复3次。
3、抗原修复暴露抗原决定簇
（1）切片放入0.01M柠檬酸纳缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火4分钟至沸腾后，再加热6分钟，重复4次，每次间隔补足液体，防止干片。
4、封闭非特异性蛋白
（1）盛有1×PBS的铁盒中洗3分钟，重复3次；
（2）将切片取出，周围水分用滤纸吸干，用组化笔在组织周围画上圈，在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中，室温30分钟。
5、一抗孵育
甩去切片上的羊血清，用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗后，放入湿盒中室温2小时。
6、二抗孵育
（1）将一抗体倒掉并用PBS洗5分钟，重复5次；
（2）用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37°C恒温烤箱中30分钟；
（3）盛有1×PBS的铁盒中洗5分钟，重复5次。
7、显色
在切片上加入DAB,显色时间控制在大约5分钟，通过镜下观察颜色控制时间。
8、复染、脱水、透明、封片
（1）盛有1×PBS的铁盒中洗3分钟，重复3次后，用双蒸水洗5分钟；
（2）加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20秒后用自来水冲洗，双蒸水洗5分钟，再用PBS返蓝5分钟。
（3）脱水按下列顺序依次进行：
盛有50%乙醇的玻璃缸中 1-2分钟；
盛有70%乙醇的玻璃缸中1-2分钟；
盛有95%乙醇的玻璃缸中1-2分钟；
盛有95%乙醇的玻璃缸中1-2分钟；
盛有100%乙醇的玻璃缸中1-2分钟；
盛有100%乙醇的玻璃缸中1-2分钟；
（4）透明：盛有二甲苯的玻璃缸洗1-2分钟，重复3次；
（5）封片：中性树胶。取100ul左右中性树胶均匀在盖玻片上涂一层，倒扣在盖玻片上，让封片剂自然扩散，切勿用力按压，以免损坏切片。同时注意避免气泡产生。
 
（二）冰冻切片免疫组化参考实验流程（SP法为例)
 1、 4-8μm的冰冻切片，室温放置30分钟后，挑选此次实验所用的冰冻切片放入4℃丙酮固定10分钟，之后放入盛有1×PBS的不锈钢盒中漂洗5分钟，重复3次。
2、用3％过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。放入盛有1×PBS的不锈钢盒中漂洗5分钟，重复2次。
3、5-10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。准备封闭用的小槽（参照实验九的方法来制作），向槽里加入适量封闭液，让切片材料面朝下与封口膜中的液体接触，把封闭液连带封口膜都吸附在表面，轻轻颠倒切片，使液体均匀地与材料接触，正置于湿盒的海绵上，孵育10分钟。
4、用镊子去掉封口膜，把冰冻切片竖直于无尘纸上，让封闭液流下而被纸吸走。表面剩余的封闭液用无尘纸轻轻吸走，尽量吸尽液体但切勿触碰组织样品表面。同步骤3自制若干杂交所用小槽，加入稀释好的一抗，切片材料吸附液体后正置于湿盒海绵上，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。
5、同步骤4用无尘纸吸掉一抗液体，把切片装入切片架，放入盛有1×PBS的铁盒中润洗5分钟，重复3次。
6、同步骤4用无尘纸吸走多余PBS，同步骤3自制若干杂交所用小槽，滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），切片材料吸附液体后正置于湿盒海绵上，37℃孵育10-30分钟。
7、同步骤4用无尘纸吸干液体，把切片装入切片架，放入盛有1×PBS的铁盒中润洗5分钟，重复3次。
8、 同步骤4用无尘纸吸走多余PBS，同步骤3自制若干杂交所用小槽，滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉亲和素（PBS稀释），切片材料吸附液体后正置于湿盒海绵上，37℃孵育10-30分钟。
8、同步骤4用无尘纸吸干液体，把切片装入切片架，放入盛有1×PBS的不锈钢盒中润洗5分钟，重复3次。
9.显色。步骤可参考石蜡切片免疫组化步骤。
10.自来水充分冲洗，复染，封片。步骤可参考石蜡切片免疫组化步骤。 
                         
思考题：实验结果若出现下列情况时原因有哪些，（1）有很多非特异性染色（2）弱阳性?
 
 
附录：免疫组化常用试剂配方
1、PBS(PH7.2) 0.01M
  NaCl                                       8g
  Na2HPO4                                1.15g
  KH2PO4                                  0.2g （NaH2PO4）
  加双蒸水至                               1000ml
 
2、1M的TBS缓冲液（pH8.0）：
Tris碱                            121g
去离子水                          800ml
用1M的HCl调至pH=8.0, 定容至1000ml。 

 
3、 3%甲醇-H2O2溶液：用30% H2O2和80%甲醇溶液配制。
 
 4、封固剂：
 a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合； 
 b、甘油和TBS(或PBS)配制。  

 
5、0.05M TBS(PH7.4)
  Tris(三羟甲基胺基甲烷)                  12.1g
  Nacl                                        17.5g
  加双蒸水至                               1500ml
在搅拌下加浓HCL至PH7.4，再加双蒸水至2000ml。

6、0.02M TBS（PH8.2）
  Tris                                         4.84g
  Nacl                                        17.5g
  BSA                                         2.0g
  NaN3                                       1.0g
  加双蒸水至                               1500ml
在搅拌下加浓HCL至PH8.2，再加双蒸水至2000ml。
（BSA—牛血清白蛋白；NaN3—叠氮钠，为防腐剂）。
 
7、DAB (Diaminobenzidine) 显色液
      DAB（3.3—二氨基联苯胺四盐酸盐）     50mg
      0.05M TB(或0.01M PBS)               100ml
      30%H2O2                              30~40μl
配制方法：先以少量0.05MTB（或0.01MPBS）溶解DAB，充分溶解后加入      剩余的TB或PBS，摇匀后（避光）过滤，显色前加入30% H2O2，宁少勿多，便于掌握反应过程。阳性为棕黄色颗粒。DAB有致癌作用，操作时应格外小心，避免直接与皮肤接触，用后的器皿应充分冲洗，用后的DAB液不应冲入下水道，应集中深埋或清洁液处理后弃之。
 
8、DPX(Distrene, Plasticiser, Xylene)封片剂
聚苯乙烯（Distrene 80）                      10g
  酞酸二丁酯                                        5ml
  二甲苯                                             35ml
  DPX为中性封固剂，用于多种染色方法均不易褪色，但使组织收缩较明显，故应 尽量使其为均匀的一薄层。
 
9、封闭通透液
PBS   40ml
TritonX-100    120μl
加热数分钟后，临用前加400μl30%H2O2。
 
10、0.01M柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）
A液：柠檬酸    10.5g 加双蒸水至1000ml
B液：柠檬酸钠29.41g 加双蒸水至1000ml
使用时28mlA+72mlB+200mlddH2O。