一、实验目的：掌握免疫荧光技术的原理和意义，了解免疫荧光分析技术在观察和研究基因表达中的作用。

二、免疫荧光技术的实验原理：免疫学的抗原抗体反应具有高度的特异性。免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称免疫荧光抗体技术，就是利用这种抗原抗体反应的特异性，将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体上，用其在待测胚胎组织或细胞中与其相应的抗原进行结合后，即可以在荧光显微镜下通过检测特定的荧光而进行组织或细胞内抗原物质的定位。相反，也可用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。但是在实际工作中荧光抗体方法较常用,荧光抗原法很少应用。利用荧光免疫技术也可以对抗原进行定量，即在抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度，称为免疫荧光测定技术。用免疫荧光技术在蛋白质水平上进行基因表达产物（抗原）定位的主要优点是特异性强、敏感性高、速度快，无污染；主要不足之处是非特异性染色问题尚未完全解决，技术程序也比较复杂。

许多物质都可产生荧光现象，但只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能作为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有 (1)异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂，分子量389.4，最大吸收光波长490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC有两种同分异构体，其中的异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，可在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。 (2)四乙基罗丹明（rhodamine，RB200）为橘红色，性质稳定，可长期保存的粉末；不溶于水，易溶于酒精和丙酮；最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。(3)四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC），最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。此外，某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮即可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。

荧光素的选择主要原则是：（1）能与蛋白质形成共价键的化学基团（如异硫氰基（-NCS等），以便于对蛋白质进行标记：（2）安全无毒，标记后不影响蛋白质的生物学活性和免疫活性，也不明显影响荧光素的荧光效率。

1、直接染色法：直接将荧光素连接在待检测抗原的特异抗体上，标记的特异荧光抗体直接加在待测样品上，经一定温度和时间的染色，洗去未参加反应的多余荧光抗体，在荧光显微镜下便可见到被检抗原与荧光抗体形成的特异性结合物而发出的荧光。直接染色法的优点是：特异性高，操作简便，比较快速。缺点是：一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。直接法应设阴、阳性标本对照，抑制试验对照。

2、间接染色法：先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与待测抗原标本进行反应，作用一定时间后，洗去未反应的抗体；然后再用标记的抗第一抗体的抗体即（第二抗体）与待测样品反应，则荧光素标记的第二抗体与第一步中被抗原固定在样品中的第一抗体进行反应，形成抗原-抗体-抗抗体复合物。洗去未反应的标记第二抗体后，即可在荧光显微镜下规矩荧光对待测抗原进行定位。在间接染色法中，第一步使用的未用荧光素标记的抗体起着双重作用，对抗原来说起抗体的作用，对第二步的抗抗体又起抗原作用。由于免疫球蛋白有种属特异性，因此标记的抗球蛋白抗体必须用第一抗体同种的动物血清球蛋白免疫其他动物来制备。间接染色法的优点是用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同动物的同一抗体结合，检查各种未知抗原或抗体，而不需要对每种抗体进行标记。缺点是由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，判定结果必须有多种不同对照（除应设阴、阳性标本对照外，还应设用阴性血清代替阳性血清的对照。

1、实验器材：荧光显微镜，激光共聚焦显微镜，冰冻切片机，滤纸，丙酮，免疫组化笔，玻片架，37℃温箱，不锈钢盒或者搪瓷盒三只，有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的海绵和纱布垫作为湿盒）。

2、实验试剂：

4%PFA；1% triton X-100；血清；甘油；0.01M PBS（磷酸盐缓冲液）pH7.4；荧光标记的抗体溶液：以0.01M，pH7.4的PBS进行稀释；缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制.

1、镜检标本的制备：待测的胚胎组织样品经冰冻切片或石蜡切片（见实验六，七）而制备用于再荧光显微镜下进行免疫荧光分析的镜检标本。为减少杂质干扰，在有冰冻切片机的条件下最好用冰冻切片。因此，下面只以冰冻切片为例介绍检测基因表达的免疫荧光分析技术。

2、冰冻切片4-8mm,室温放置30分钟以解冻。

3、挑选此次实验所用的冰冻切片，放于切片架中，浸泡在装有4%PFA的不锈钢盒里20分钟，用来固定组织样品。

4、放入盛有1×PBS的不锈钢盒中浸泡5分钟，重复3次，以去除OCT。

5、把切片从切片架中取出，用无尘纸擦拭干组织样品外的全部区域。根据组织大小剪一些封口膜，大约是0.8cm*1.2cm，用宽口镊子把封口膜两边夹成与膜垂直的程度，制成一个小槽形状。向槽里加入80ul左右的5%BSA/PBS封闭液，让切片材料面朝下与封口膜中的液体接触，把封闭液连带封口膜都吸附在表面，轻轻颠倒切片，使液体均匀地与材料接触，正置于湿盒的海绵上，孵育1小时。

6、用镊子去掉封口膜，把冰冻切片竖直于无尘纸上，让封闭液流下而被纸吸走。表面剩余的封闭液用无尘纸轻轻吸走，尽量吸尽液体但切勿触碰组织样品表面。7、用5%BSA/PBS封闭液按一定比例稀释一抗，同步骤5自制若干杂交所用小槽，加入稀释好的一抗，切片材料吸附液体后正置于湿盒海绵上，4℃孵育过夜。

8、同步骤6用无尘纸吸掉一抗液体，把切片装入切片架，放入盛有1×PBS的铁盒中润洗10分钟，重复3次。

9、同步骤6用无尘纸吸走多余PBS，同步骤5自制若干杂交所用小槽，加入用5%BSA/PBS稀释好的对应荧光二抗和DAPI染料，切片材料吸附液体后正置于湿盒海绵上，室温孵育1小时, 此步需注意避光操作。

10、同步骤6用无尘纸吸干液体，把切片装入切片架，放入盛有1×PBS的铁盒中润洗10分钟，重复3次。

11、准备好盖玻片，用ddH₂O冲洗后浸泡于乙醇中，5分钟后无尘纸擦干。在洗干净的盖玻片上加入20ul封片剂。将拭干的切片倒扣在盖玻片上，让封片剂自然扩散，切勿用力按压，以免损坏切片。室温避光孵育30分钟，封片剂凝固即可。可以用普通封片剂封片，若想要更好的效果和使荧光维持得更久些则可以用抗荧光淬灭封片剂来封片。

10、荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜观察、拍片和分析。

 

思考题：影响基因表达免疫荧光分析结果的因素有哪些？如何判断结果的特异性？

 

 1、0.01M PBS(PH7.2)
  NaCl                                       8g
  Na₂HPO₄                                1.15g
  KH₂PO₄                                  0.2g （NaH₂PO₄）
  加双蒸水至                               1000ml

 

聚乙烯醇（PVA; polyvinyl alcohol） 40-88，4.8g

分析纯甘油                           12ml

蒸馏水                               12ml

0.2mol／L Tris盐酸缓冲液(pH8．5)     24ml

l，4—重氮双环—[2，2，2]—辛烷，L     25g(终浓度约2．5％)。

 

    0.2mol/L Na₂CO₃                    4.0 ml

    0.2mol/L NaHCO₃                    46.0 ml

 

4、碳酸盐荧光封片剂：

NaHC0₃                             3.7g

无水Na₂CO₃                         0.6g

三蒸水                             100m1，

然后与甘油1:1混合，4℃保存。

 

5、磷酸盐荧光封片剂：

甘油                           200μl

0.01M的PBS                  800μl

1×PBS, 0.1%Tween-20, 4°C保存