一、实验目的：在多细胞生物胚胎发育过程中，调控胚胎形体模式形成、细胞、组织和器官发生的基因只在特定的时间在特定的组织和细胞中表达，称为基因表达的细胞特异性或组织特异性。整胚原位杂交可以直观地显示基因在胚胎上表达的部位，但不能精细地分辩在胚胎内部组织的那些细胞中表达。只有在胚胎切片上进行原位杂交才能清楚地分辩基因表达的组织和细胞特异性。本实验的目的是学习切片原位杂交技术的基本原理、操作方法和在发育生物学基因表达研究中的应用。

二、组织特异性原位杂交的基本原理：与整胚原位杂交的原理相同，即经特定标记的核苷酸链为探针，可与胚胎或者组织切片标本中的待检目标基因的mRNA进行杂交而形成复合体，然后通过对标记物显色而确定目标基因mRNA在胚胎的什么组织和细胞中表达。

按所带标记物性质的不同，探针可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。常用的同位素标记物有³H、³⁵S和³²P。用同位素标记物探针有灵敏度高的优点；但是实验周期比较长（约1周），并且放射性同位素对人和环境均会造成伤害。现在对表达丰度比较高的基因，一般采用非同位素标记探针。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。 按核酸不同性质，探针可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针等。cDNA探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。在实验中应根据杂交实验要求不同和基因表达丰度的不同选择不同的核酸探针。在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。例如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针、RNA探针或寡核苷酸探针。长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交，因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。

1、实验器材：恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、盖玻片、封口膜、移液器、暗盒、枪头、塑料量筒、磁力搅拌子、镊子、玻璃量筒、烧杯。

2、实验试剂：（1）1×DEPC-PBS, Sheep serum,4% PFA(用1XDEPC PBS配置)；（2）1M DEPC-Tris缓冲液 pH7.5(由于DEPC能与Tris发生化学反应，因此需先配DEPC（碳酸二乙酯）水，然后用DEPC水配Tris缓冲液)；（3）1M 三乙醇胺（TEA, Triethanolamine）pH8.0；（4）1M 三羟甲基氨基甲烷 (Tris)pH9.5；（5）5M 氯化钠（NaCl）；（6）1M 氯化镁(MgCl2)；（7）20×SSC（RNase free），pH 7.0；（8）甲酰胺；（9）面包酵母（Bakers yeast） tRNA；（10）鲱鱼精DNA（ Herring sperm DNA）；（11）NBT/BCIP；（12）地高辛抗体 (Ab anti-DIG)；（13）50×Denhart’s。

3、材料：新切的胚胎、组织冰冻切片或石蜡切片。

4、注意事项：

（1）采用冻存管包装的试剂，请在开盖前稍加离心，以免试剂损失。

（2）按顺序混合配制，避光，配制后应现用。

（3）禁让切片在杂交和染色过程中出现干涸现象。    

（4）杂交液用量务必与盖玻片规格匹配，否则将容易出现非特异背景。    

（5）如果间质细胞出现非特异着色，很可能是杂交后操作过程中出现干片或杂交后冲洗不充分所引起。

（6）在手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有RNA酶防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。

冰冻切片的原位杂交实验流程：

第一天

溶液的配置及耗材准备：枪头，塑料量筒，磁力搅拌子，塑料量筒，镊子等用DEPC处理过后高温高压灭菌，玻璃量筒，烧杯，铁盒160℃烘烤3.5小时。

1、在开始做原位杂交的前一天将杂交用的湿盒及其里面的海绵洗干净，用SSC/甲酰胺溶液浸泡过夜。SSC/甲酰胺溶液的配法为：20×SSC 20ml，                 甲酰胺 200ml，DEPC处理过的H₂O 380ml。

2、第二天早上配新鲜的多聚甲醛（PFA）溶液：将20克多聚甲醛加入500ml DEPC配置的PBS缓冲液中，置于65℃搅拌溶解。

3、从-80℃中取出切片盒平衡至室温，注意其间不要将切片盒外的塑料袋取掉。

4、把切片盒放入烘箱中，50℃烘片15分钟，烘烤结束把烘箱温度调到65℃。

5、在一个染色缸倒入4%PFA溶液，将烘烤好的片子插入玻片架上，放入PFA溶液中5分钟。

6、在第二个染色缸中倒入适量的DEPC-PBS溶液，将玻片处理5分钟后放入另一个装有蛋白酶K（Proteinase K）的染色缸中。

7、蛋白酶K处理10分钟，此时开始配400ml三乙醇胺（1M Triethanolamine + 1ml 醋酸酐），用磁力搅拌子搅动混匀。

8、DEPC-PBS 清洗5分钟，重复3次。

9、4%PFA 固定10分钟。

10、DEPC-PBS清洗5分钟，重复3次。

11、三乙醇胺处理10分钟。

12、新鲜的DEPC-PBS 清洗5分钟,重复3次。

13、室温预杂交 1小时。把切片从切片架上取下，用无尘纸巾擦试标记外的全部区域将封口膜剪成标记区域大小，用镊子在膜两端压出凹槽，在膜上滴100µl杂交液，用切片的正面区贴膜，正置于湿盒的海绵上，放平，以免杂交液流出。

14、65℃杂交过夜。每100µl杂交液加0.5µl探针，混匀后100℃干浴5分钟，之后的操作与预杂交相同。杂交盒必须要密封性好，为防止杂交液挥发，可用保鲜膜将杂交盒包起来后放于杂交炉或是烘箱。

第二天：

1、开65℃水浴，配0.2×SSC，一盒置于室温，3盒放入65℃水浴，使其温度上升至65℃。把湿盒从烘箱中取出，小心掀起膜，勿碰到组织部分，把切片竖直，使杂交液流下，用0.2×SSC，室温漂洗

2、0.2×SSC， 65℃， 20分钟。重复3次。 此时开始配置B1 和B2 缓冲液。

3、0.2×SSC，室温，5分钟。

4、B1 缓冲液，室温，5分钟。

5、B2缓冲液，室温，1小时。每张切片100µl，剩余的B2用于配抗体溶液。

6、地高辛抗体+B2 缓冲液，1：5000，4℃，过夜。

第三天 

1、把湿盒从4℃冰箱取出，揭开膜，竖直切片，拭干标记内外除组织外的其它区域，然后将玻片放入B1 缓冲液，20分钟，重复3次。

2、将玻片放入B2 缓冲液，5分钟， 重复2次。

3、将玻片放入B3 缓冲液，5分钟，重复3次。

4、把玻片从B3溶液中取出，拭干切片组织外所有区域。在干净的盖玻片上加200µl B4缓冲液（避光），用切片去贴盖玻片。

5、在显微镜下观察染色情况，一般半小时左右可终止显色反应。

6、显色结束后，用1×PBS 清洗 5分钟 ，重复 2次。在干净的盖玻片上加20µl封片液，用擦干净的切片去贴盖玻片进行封片。

 

一、脱蜡复水
二甲苯20分钟--二甲苯l0分钟-- --100%乙醇5分钟--95%乙醇5分钟--70%乙醇5分钟—50%乙醇5分钟

二、 处理及杂交
1)将载玻片从50%乙醇中置于DEPC处理过的水中，漂洗5分钟，重复2次；

2)转入0.02M PBS (PH7.4)，漂洗5分钟，重复2次；

3)用5μg/m1 蛋白酶K消化处理，37°C 30分钟。用Tris-EDTA(0.1M     Tris,0.05M EDTA,（pH 8.0) 溶解蛋白酶K ,EDTA可鳌合核酸酶Mg2+，防止假阴性结果。

4) 2mg/ml 甘氨酸-PBS漂洗5分钟；

5) PBS(0.02 M, pH7.4) 漂洗5 分钟，重复2次；

6) 4%多聚甲醛- PBS，固定20分钟；

7) PBS (0.02 M, pH7.4) 漂洗5 分钟，重复2次；

8) 0.2 M HCl中处理15分钟；

9) PBS ( 0.02 M, pH7.4) 漂洗5 分钟，重复2次

10) 三乙醇胺、 醋酸酐（每毫升0.1M三乙醇胺加2.5μ1醋酸酐）中处理10分钟；

11) PBS (0.02M, pH7.4) 漂洗5分钟;以上操作均在染色缸进行；

12) 45°C预杂交中预杂交2-3小时。

13)乙醇梯度脱水

50%乙醇5分钟—70%乙醇5分钟—95%乙醇5分钟—无水乙醇5分钟；
14)杂交，45°C, 过夜。6μl探针加入到40μ1杂交液煮沸，立即置于冰上。然后加入到2-3ml 45°C预热的杂交液中。每片滴加50μ1。放在湿盒中，密闭。15)2×SSC, l0分钟，重复2次。
16)2×SSC, l5分钟, 60°C，重复2次。
17)1×SSC, 15分钟, 37°C，重复2次。
18)RNase消化处理吸附的探针，20μg/ml, 50分钟, 37°C 。
19)0.1×SSC, 30分钟, 37°C, 重复2次。

可先用0.1×SSC过一下;如背景高，此步可改2×SSC+ 50%甲酰胺，52°C。
20)washing buffer（清洗液）(0.1M Tris+ 0.15 M NaCl, pH7.4)清洗10分钟，重复2次。

21)1% 封阻剂 封阻2 小时(用0.1M Tris pH7.4, 0.15M NaCl配制)，为节省起见，可直接滴在载玻片上。
22)地高辛抗体 (1:1000，用封闭剂配制)，室温孵育2小时。
23)Tris-NaCl 缓冲液(0.1M Tris pH7.4, 0.15M NaCl)漂洗20min，重复4次。
24)TMN 缓冲液 (PH8.0) 漂洗10分钟。

25)显色。NBT/BCIP+lavamisole（左旋咪唑）用TMN 配制。

26)镜检。

27)照相。

 

NaCL              40g

KCL                1g

Na₂HPO₄.12H₂O     17.4g

KH₂PO₄             1.2g

用 5M HCL调整pH值， 加250μl DEPC，搅拌充分后，高压灭菌。

 

2、4%多聚甲醛（Paraformaldehyde）(pH 7.0):
称取40g多聚甲醛溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热
磁力搅拌至60－65℃,使成乳白色悬液。用1.0mmol/L 的NaOH调PH至7.0使呈清亮状（滴加），再加入约500ml 2×PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中）。可再检测一下PH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃（保存备用）。

Glycine （甘氨酸）   3g

加1×PBS至终体积为 400ml.

 

EDTA （0.5M）                   4ml

Tris     pH7.5                  20ml

蛋白酶 K(20mg/ml)            40µl

DEPC-H₂O                     376ml

总体积                       400ml  

5、0.1M三乙醇胺 （TEA buffer）:

三乙醇胺            533μl

10M HCL             80μl

加 RNase-free ddH_{2至终体积40ml}O

20×SSC                1ml

Formamide（甲酰胺）   2.5ml

RNase-free ddH₂O      1.5ml

20×SSC                            1ml

50% Dextran sulfate（硫酸葡聚糖） 1ml

50×Denhardt′s solution        100μl

0.5M EDTA                        20μl

Formamide（甲酰胺）              2.5ml

鲑鱼精 DNA (20mg/ml)             125μl

RNase-free ddH_2μl O                 380

1M Tris pH 7.5     40ml

5M NaCl            12ml

ddH₂O               348ml           

Total               400ml

1ml B1缓冲液加 100µl 羊血清，混匀。

1M Tris pH9.5      40ml

5M NaCl             8ml

1M MgCl₂            20ml

ddH₂O              332ml

总体积             400ml

1ml B3 + 20µl NBT/BCIP   避光

1M Tris Hcl(pH 7.5)           3.5ml

1.5M Nacl                     3.5ml

TritonX-100                   35μl

10% 封阻剂（Blocking reagent）3.5ml

加水至终体积35ml

lM Tris pH8.0   lm l

1M MgCl2        0.5 m1

5M NaCl           0.2m l  

加DEPC水至10ml

TMN缓冲液                 988μl

NBT(50mg/ml)                8μl

BCIP(50mg/ml)               4μl

0.5M Levamisole （左旋咪唑）2μl

聚蔗糖8000（Ficoll 8000）                     0.2g

聚乙烯吡咯烷酮(PVP, polyvinyl pyrrolidone)    0.2g

牛血清白蛋白（BSA）                           0.2g

DEPC水到l0ml，1.0μm滤膜过滤。