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发育生物学实验

实验七 基因表达研究的冰冻切片技术

来源：浙江大学生物学国家级实验教学示范中心

时间：2023-03-23 15:40:30

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一、实验目的：为研究和确定特定的基因在胚胎的哪些组织和细胞中表达，需要对胚胎进行切片后再进行基因表达的原位杂交。冰冻切片可以对新鲜胚胎和组织等进行快速切片以保持其蛋白质和mRNA 等大分子不被降解、变性，有利于对这些分子进行准确的细胞定位分析。本实验以受精后24h的斑马鱼胚胎为材料进行冰冻切片，以学习基因表达研究的冰冻切片技术。
二、实验器材与材料：
1、实验仪器和器材：
MICROM HM525型冰冻切片机（图7-1），显微镜，28.5℃恒温水浴设备，恒温水浴锅，PH值测定仪。
培养皿，锡箔纸盒，载玻片，盖玻片等。
 
图7-1. MICROM冰冻切片机HM525外观
 
图7-2：冰冻切片机控制面板
1＝回退指示灯，2＝切片厚度设置键，3＝修片厚度设置键，4＝精细推进指示灯，5＝修整推进指示灯，6＝粗进，退回，7＝粗进，向前，8＝修片键，9＝滚屏键，10＝显示屏（左侧），11＝重置键，12＝记忆键，13＝解冻时间设置，14＝解冻程序中止，15＝向下键，热点元件激活，16＝向上键，17＝冷冻箱照明，18＝显示屏（右侧）
 
 
 

1=夹紧摇杆   

2=定位摇杆
 
 
 

 

图7-3 冰冻切片机冷冻箱                  图7-4.样品定位装置
 
图7-5 刀片运送器
1＝松紧摇杆，2＝松紧摇杆，3＝松紧摇杆，4＝标尺，5＝松紧摇杆，6＝螺纹旋扭，7＝刀片保护器，8＝隔离棒，9＝刀片插槽，10＝翻卷板，11＝制动螺栓
2、实验试剂及配制：
（1） OCT包埋剂（美国 Sakura公司产品）。
（2） 1×PBS: 配制方式见实验四。
（3） 20%蔗糖溶液：10g蔗糖（上海生工）加入50ml DEPC处理的1XPBS摇匀溶解。
（4） 40%蔗糖溶液：20g蔗糖（上海生工）加入50ml DEPC处理的1XPBS摇匀溶解。
三、实验步骤
1、斑马鱼胚胎的获得： 参照实验3
2、斑马鱼胚胎受精膜的去除：参照实验3
3、胚胎材料固定处理：用大口径吸管选取一定的胚胎置于装有4%PFA的EP管中，4℃固定过夜。
4、材料处理和包埋：
（1）用DEPC处理过的1×PBS清洗胚胎。
（2）用20%蔗糖溶液脱水 4℃过夜  
（3）用40%蔗糖溶液进一步脱水 4℃过夜  
（4）根据胚胎的前后上下位置在折好的锡箔纸小盒上作好标记，加入适量的OCT，用挖耳勺或解剖针调整好胚胎方向后，-20℃包埋，待冷冻好后即可开始切片，或可以置于-80℃保存。
5、冰冻切片
冰冻切片机控制面板见（图7-1，2）
a.打开冰冻切片机，轻轻按下15或16上下调节，将温度设定到-25℃，待切片机温度达到-25℃后将包埋材料从-80℃冰柜中取出放到冰冻切片机里。打开冷冻箱照明，安装刀片,放下刀片保护器。
b.用OCT将材料固定到垫架上，按下7向前粗进，调整好样本与刀片的距离后，先修片（按8），按3预设的修整值通过相应的LED指示灯显示。
c.当对样本和刀片进行调节后，且对样本进行了修整后，在显微镜下观察，当接近所需的部位时，此时开始切片，放下防卷板，顺时针转动手轮，产生切片，切片划入刀片和防卷板之间。按3设置切片的厚度。冰冻切片的厚度一般是10-20µm，mRNA原位杂交用10µm。切片过程中可以通过带螺纹的旋扭对防卷板进行精细调节。
d.贴片。切片贴于刀片的表面，用刷子或镊子将切片移至玻片上。将切片尽量展开，用载玻片的毛面去贴片，显微镜下观察，挑选质量较好的切片，用标记笔画出来，在毛面上写上要杂的探针、日期及切片编号。
d.切好的片子可以直接显微镜下观察，或放于切片盒中，用塑料袋将切片盒包好放于-80℃保存，用于后续的杂交。
e.切片结束后，将垫架退回至最后，取下垫架，将剩余的材料去除。从运送器上去掉刀片，并将其储存在盒子内。取出刷子架、工具和夹盘。将手轮柄摇至上方位置。清理废片托盘。关闭电源，待冷冻箱中的冷凝水蒸发干净关闭机箱门。
四、注意事项：
1.防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
2.放置材料，应根据锡箔纸上的标志注意斑马鱼的前后及上下位置。　
3.为防止冻伤及接触到刀片划伤手指，应带好防护手套，贴片时将刀片保护器放在刀片的边缘上。　
4.用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。
5.若直接用于观察横切面表型，用普通清洗干净的盖玻片和载玻片即可。若要后续进行原位杂交和免疫组化等，需保证无DNase和RNase干扰。
6.多个样本同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片。