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发育生物学实验

实验六 基因表达研究的石蜡切片技术

来源：浙江大学生物学国家级实验教学示范中心

时间：2023-03-23 15:18:30

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一、实验目的：大多数生物材料在自然状态下是不适合显微观察的，也无法看到其内部结构。生物显微制片是组织学、胚胎学、及细胞学等学科研究观察细胞、组织的生理、病理形态变化的一种主要方法。生物显微制片有许多不同的方法，一般可分为非切片法与切片法两大类。而切片法又包括石蜡切片法、冰冻切片，和电子显微镜观察的超薄切片法等。石蜡切片显微标本的制作技术是经过固定，脱水，透明，包埋等程序后再把材料切成较薄的片子和用不同的方法染色，以在显微镜下清楚地看到不同组织和细胞的形态以及其中组分的差异。经封片处理后的石蜡切片可以进行长期保存。本实验的目的是了解石蜡切片的制作技术和程序，掌握石蜡切片技术。
二、实验器材、材料和试剂
1、器材：切片机、展片仪、烤片机、毛笔、载玻片、盖玻片、烤箱、刀片、恒温箱、熔蜡炉、蜡杯、酒精灯、吸管、镊子、包埋盒、染色缸、
2、材料：胚胎或者成体组织。
3、试剂及配制：二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇、石蜡、中性树脂、苏木精、伊红、氨水。
三、实验步骤
石蜡切片总的技术的程序包括：取材——固定——冲洗——脱水——透明——浸蜡——包埋——切片——贴片——复水——染色——脱水——封片——镜检等技术程序。分述如下：
1、取材：根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤或者干枯等。所采集材料应该立即放入固定剂，并编号，注明采集的详细信息。所采取的组织块大小要适当，要考虑固定剂的穿透能力。一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，植物组织取材稍小，动物组织取材要稍大。
2、固定：胚胎或者组织被切割后，由于细胞内酶的作用和细菌的繁殖，可导致组织的自溶和腐坏。因此，应立即对所取材料进行固定处理。固定的主要作用是：（1）防止组织自溶和腐坏而尽可能保持原有的形态结构；（2）使细胞内的蛋白质、糖、脂质等各种成分沉淀下来从而保存细胞的各种组成成分；（3）因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的固定剂还有助染作用，从而使细胞各部易于染色；（4）固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易变形，有利于操作。固定是制片极为关键的一个步骤，制片质量的优劣除与材料的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定是否适当和完全。
固定的方法包括（1）物理方法：干燥、高热、低温骤冷等；（2）化学方法：化学试剂配制成固定液使之固定，常有酒精、福尔马林、醋酸、苦味酸等。
固定的注意事项：（1）固定的材料越新鲜越好；（2）材料大小以直径不超过5mm为宜，材料与固定液比例为1：20；（3）根据材料的性质和制片的目的选择固定液；（4）固定时，要防止材料变形；（5）材料投入固定液后，须经常摇晃；（7）容器外需贴标签。
3、冲洗：材料固定后，药剂继续留在组织中，易使组织破坏，必须用水或酒精洗去。
4、脱水：脱水是用一种即能与水又能与透明液混合的液体来逐渐脱去样品中游离的水。现采用的脱水剂一般是丙酮或乙醇来进行梯度脱水，脱水的时间可根据组织的类型大小而定。脱水一般是将材料依次按下列顺序放入脱水溶液中处理各10min：30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%→100%→100%。脱水应该逐步而不应跨越太大，否则将引起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙醇处理时，应保证试剂的纯度。
5、透明：透明是用一种既能与乙醇又能与包埋介质互溶的液体来置换样品中的乙醇，从而为最终的包埋创造一个有利的条件。现在采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。透明的过程依次在1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯 各处理15min。
二甲苯是使用最为广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。
6、浸蜡：将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，不断的提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置换了组织块中的透明剂，便于今后的包埋和切片。石蜡有液态与固态两种状态，透蜡要在恒定温箱（60℃）中进行，以保证石蜡处于液体状态。透蜡时间每次约1h。
7、包埋：样品经过石蜡浸透后，其内部间隙已完全被石蜡占据，此时还需要用同种硬度的石蜡包埋成蜡块以利于后边的切片，包埋可用相同的器具，也可以折叠一牛皮纸盒（图6-1）。将液态石蜡缓缓倒入纸盒中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入纸盒中，摆好位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。
至此，一块组织已完成前处理过程，可以切片。由于生物材料的个体差异，化学试剂的多样性，因此操作技术相当细致而烦杂，方法也很多，每一步骤的失误都可导致整体的失败，因此需要耐心细致，不断总结经验，多加练习，才能取得较好的结果。
图6-1 石蜡包埋纸盒的制作示意图
图6-2 固定的蜡块样品及切片机
8、切片：切片包括修块，固着，切片等过程，分述如下：
（1）修块：切片前需要修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周围的石蜡相等。
（2）固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便于固定在切片机上。
（3）切片：调整蜡块组织切片恰好与刀口接触，旋紧刀架，根据需要调整切片厚度，一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一条长蜡带。切下的蜡带放在一干净纸上。切片的厚度一般为6-10um。
9、贴片：将切好的蜡带光面向下用毛笔挑起，轻放于干燥洁净的纸上，用小刀根据需要切成数段，用毛笔挑起轻放于37℃展片机水浴中，待蜡带充分展开后，用载玻片从底部向上捞起蜡带，每张载玻片可放置数条蜡带。在恒温烤片机上，37℃烤片过夜。
10、复水：在染色之前需要先将蜡带上石蜡去除，因此必须先用二甲苯去除石蜡再用酒精去除二甲苯，再进入水中才能染色。处理步骤为：100%二甲苯 5min；100%二甲苯 5min；无水乙醇 2min；无水乙醇 2min；95%乙醇 2min；70%乙醇 2min；去离子水 2min；去离子水 2min。
11、染色：染色的方法很多，要根据每张标本要求显示的目的选择不同的染剂，最常用的是苏木精，伊红染色。苏木精使细胞核显深紫色，伊红使细胞质显粉红色，以此显示清晰的细胞形态和核 的大小，位置。处理步骤为：将上述玻片放于10%伊红染液中，染色约30s，若染色过重，可用95%乙醇稀释染液，或缩短染色时间。
12、脱水：染色后将切片样品依次放入100%乙醇2min；100%乙醇 2min；100%二甲苯 2min；100%二甲苯 2min中进行脱水处理。
13、封片：将完成制片全过程的组织材料用封藏剂封固以便长期保存。一般用中性树脂封片。
14、镜检：封片好后干燥、镜检、贴标签，拍照。
 
作业：拍摄所做材料的石蜡切片照片。
 
附录：苏木精和伊红染料的配制
苏木精染液：苏木精（2g），冰醋酸（10ml），甘油（100ml），95%酒精（100ml），蒸馏水（100ml），硫酸铝钾（5g）
配制步骤：1.将苏木精溶于少量酒精中，加冰醋酸后搅拌，加速其溶解；2.加入甘油及其余酒精；3.研碎钾矾，溶于水中并加温；4.将加温的钾矾溶液一滴滴地加入染色剂中，并不断搅动；5.瓶口用双层纱布包扎，放于通风处，并经常摇动，直到颜色变为紫红时即可使用，成熟时间约需2-4周以致数月之久，若加0.2g碘酸钠即可立即成熟。已成熟的原液，须用瓶塞密封，置低温暗处长期保存。使用时以原液1份加入50%酒精与冰醋酸等量混合液1份或2份即可。
伊红染液：
（1）水溶性伊红染液
伊红     0.5 - 1g
蒸馏水   100ml
先将水溶性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒将伊红搅起泡沫后过滤，每100ml加冰醋酸1滴。
（2）醇溶性伊红染液
伊红     0.5 - 1g
95%酒精 100ml

先将伊红溶于酒精中，用玻璃棒研碎溶解后，每100ml加冰醋酸1滴。用醇溶性伊红染液染细胞浆后可不经水洗直接用85%酒精脱水。