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发育生物学实验

实验五 基因表达的整胚原位杂交分析

来源：浙江大学生物学国家级实验教学示范中心

时间：2023-03-23 15:00:30

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一、实验目的：在胚胎发育过程中基因都是按严格的时空模式进行表达。本次实验以斑马鱼脊索中胚层标记基因ntl为例，进行整胚原位杂交分析其在斑马鱼胚胎原肠期的空间表达模式。
二、mRNA原位杂交的原理：RNA原位杂交是运用cDNA或寡核苷酸等探针检测细胞、组织和胚胎内目标基因mRNA表达的一种原位杂交技术，它能够将目标基因在胚胎上表达的部位直观而明确的展现出来。其基本原理是：在胚胎细胞和组织结构保持不变的条件下，用与目标基因mRNA互补并连接了地高辛等标记物的反义序列作为探针，在胚胎上与待测目标基因的mRNA结合而形成杂交体（Hybrids）；然后再用标记物的识别抗体，通过组织化学或免疫组织化学方法在形成杂交体的位置形成可在显微镜下观察到的杂交信号，从而确定目标基因的空间表达模式。
三、实验器材和材料：
1、实验器材：体视显微镜，28.5℃恒温水浴设备，恒温水浴锅，PH值测定仪，斑马鱼养殖设备（加热棒，曝气设备），分子杂交炉，真空泵，水平摇床等。培养皿（中号，大号各5组），胶头滴管若干，移液枪，2ml 离心管（无DNase/RNase）,锡箔纸等。
2、溶液配制：
（1）1×PBS；（2）0.25%胰蛋白酶；（3）1×Hanks液等的配制和使用见实验六。
（4）4%PFA(wt/vol):称取20g多聚甲醛(paraformaldehyde PFA)溶于经DEPC处理的500ml 1×PBS溶液，65℃水浴加热，持续搅拌至溶液澄清，冷却至室温，冰上过滤、分装，-20℃放置。
（5）PTW: 1×PBS,0.1%Tween-20(vol/vol)。
（6）20×SSC:购自上海生工，4℃放置备用
（7）10%CHAPS: 5g CHAPS粉末（上海生工）溶于50ml RNase-free 双蒸水中，分装，-20℃放置。
（8） 100mg/ml Heparin: 称取100mg Heparin（上海生工）溶解于1ml RNase-free 双蒸水中。
（9）10mg/ml Yeast tRNA : 称取2 mg Yeast tRNA(Roche)溶于2 ml RNase-free 双蒸水，分装，-20℃放置。
（10） 10% Tween-20（vol/vol）：5ml Tween-20中加入45ml RNase-free 双蒸水。
（11） 5M NaCl:称取146.1gNaCl（上海生工），加水定容至1L，充分溶解，灭菌后室温保存。
（12） 1M Tris-HCl：称取121.1gTris置于1L烧杯，加入800ml双蒸水搅拌溶解，用HCl调至pH9.5,定容至1L，灭菌后室温保存。
（13） 1M MgCl2：95g MgCl2粉末溶于1L双蒸水中，灭菌后室温保存。
（14） 杂交液（Hybridization mix, HYM）：50%去离子甲酰胺，1.3×SSC,5 mM EDTA, 0.2% Tween-20，100μg/ml Heparin, 50μg/ml Yeast tRNA。
（15） Blocking Buffer：1×PBS，2% Sheep Serum，2 mg/ml BSA，0.8% GoatSerum，0.1% Tween-20(vol/vol)。
（16） Staining Buffer：100 mM Tris-HCl(pH 9.5),50 mM MgCl2,100 mM NaCl,0.1% Tween-20(vol/vol)。
3、杂交用RNA探针的制备：
用位于插入片段5’端的限制性内切酶对已构建好的重组载体pB-zf ntl ORF进行单酶切，轻轻混匀后置于37℃水浴酶切4h后，取1μl点样，检测是否酶切完全，然后使用PCR纯化试剂盒(Axygen)回收线性质粒。
以线性化的重组载体为模板，采用Roche公司的体外转录试剂盒转录得到地高辛（DIG）标记的反义RNA探针。37℃水浴反应2h，加入DNase I消化质粒模板，37℃孵育15-20分钟。将上述反应体系用Roche公司的Mini Quick Spin RNA Columns进行纯化。最后将得到的ntl探针进行电泳检测，加入等体积的去离子甲酰胺，测定浓度，-80℃保存。
四、实验步骤：
1.斑马鱼胚胎的获得： 参照实验六
2.斑马鱼胚胎受精膜的去除：参照实验六
3.胚胎材料的收集：
体视镜下观察斑马鱼胚胎发育情况，发育时期的确定参照Kimmel[1]的划分标准，取原肠中晚期（70-90%下包）胚胎进行实验。用大口径吸管选取30颗左右的胚胎置于装有4%PFA的EP管中，4℃固定过夜。
4.斑马鱼胚胎整胚原位杂交
整胚原位杂交按照Thiss的方法[2]进行。具体步骤包括胚胎固定和预处理、复水和杂交、洗脱和孵育抗体以及显色等。
（1）胚胎的预处理
(a) PFA固定后的胚胎，用PTW溶液漂洗2次，5min/次。
(b) 脱水。使胚胎依次经过25%，50%，75%，100%的甲醇/PTW溶液，5min/次。然后100%甲醇洗3次，10min/次。
(c) 将胚胎置于新鲜的100%甲醇，-20℃保存。可放置数个月。
(2) 复水和杂交  （以下溶液若无确切说明，每次用量为1ml）
(a)复水，即将100%甲醇依次置换成75%，50%，25%的甲醇/PTW溶液，5min/次，然后用PTW溶液洗2次，5min/次,室温进行。
（b）用10μg/ml的蛋白酶K/PTW对胚胎进行消化。处理的时间依胚胎发育时期而异，但体节期之前的胚胎一般不进行消化处理。
(c) 4%PFA再固定，室温30min以上。
(d) 用PTW洗3次，5min/次，然后将胚胎转移至一个装有新鲜的PTW溶液的2ml离心管中。
(e) 用400μl PTW/HYM（1：1）混合液洗涤胚胎，使之沉在管底。然后再用400μl 100%杂交液洗一次。
(f) 将胚胎转移至含有400μl新鲜杂交液的EP管中，65-70℃预杂交1-4 h。
(g) 吸出预杂交的HYM（可回收），加入已经预热并含有终浓度为0.1-1 μg/ml RNA探针的杂交液，分子杂交炉中65℃杂交过夜。
(3) 洗脱并孵育抗体
准备70℃水浴、干浴，将杂交炉设置为70℃。（以下溶液每次用量为1ml）
(a) 吸出含有探针的杂交液后，用新鲜的杂交液快速洗涤胚胎一次。
(b) 依次将溶液置换成66% HYM/33% 2×SSC，33% HYM/66% 2×SSC， 2×SSC溶液，70℃，放置15 分钟
(c) 置换成0.2×SSC溶液，70℃，放置30 分钟
 
(d) 置换成0.1×SSC溶液，70℃，放置30 分钟
(e) 置换成66% 0.05×SSC/33%PTW，室温，放置10 min。
(f) 置换成33% 0.05×SSC/66%PTW，室温，放置10 min。
(g) 室温用PTW润洗胚胎2次，每次5分钟
(h) 将胚胎置于Blocking Buffer中，于室温孵育胚胎3小时以上。
(i) 按1：5000的比例在blocking buffer中加入地高辛抗体，4℃冰箱过夜。
(4) 洗脱、显色 （以下溶液每次用量为1ml）
(a) 室温，用PTW洗脱6次，15 min/次。
(b) 将胚胎转移至新的2 ml EP管中，用Staining Buffer漂洗2次，5 min/次。
(c) 按1 ml Staining Buffer加入20μl NBT/BCIP（Roche）的比例配制染色液。将胚胎转移至染色液中。
(e) 锡箔纸包住EP管，每隔10分钟在体式显微镜下观察胚胎显色情况。
(f) 待显色完成，吸去染色液，用PTW漂洗2次。
(g) 4% PFA室温固定30 min。
(h) 吸去PFA，用PTW漂洗2次。
(i) 将胚胎依次转移至50%,100%甲醇/PTW混合液，脱去背景颜色。
(j) 置换成PTW润洗两次，4℃保存或立即拍照。
五、作业：
根据原位杂交结果，分析在胚胎发育过程中ntl表达的时空模式和预定中胚层细胞在鱼类胚胎上的位置。
六、注意事项：
1、PFA具有强烈刺激味，最好在通风橱操作。
2、RNA探针合成、胚胎的固定和预处理、复水和杂交等过程中所有的实验耗材、试剂均需用DEPC处理。
3、用蛋白酶K处理可以增加细胞的通透性，探针及抗体分子更容易进入细胞。但是消化时间需严格控制，时间过长会引起胚胎形态的损伤。在本实验中，由于ntl基因的表达丰度较高，蛋白酶K消化与否不影响实验结果。
4、杂交液中的RNA探针的浓度范围为0.1-1 μg/ml，并根据所检测基因表达丰度的差异进行调节，探针浓度过高将导致背景色加深。
5、75℃洗脱过程需谨慎操作，避免对胚胎形态的损伤。
6、由于ntl的表达丰度相对较高，注意控制显色时间，显色过久过造成背景加深。
参考文献：
1. Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn 1995; 203:253-310.
2. Thisse C, Thisse B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat Protoc 2008; 3:59-69.