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发育生物学实验

实验四 基因表达与形体模式形成

来源：浙江大学生物学国家级实验教学示范中心

时间：2023-03-23 15:40:29

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一、实验目的：基因表达的严格时空控制是发育机制的核心。本次实验人工通过显微注射使斑马鱼β-catenin-2基因在胚胎发育早期过表达，干扰该基因表达的时空模式，然后观察和比较β-catenin-2基因过表达胚胎与野生型胚胎发育的差异，了解基因表达的时空控制在斑马鱼形体模式形成中的重要性。
二、实验器材和材料：
1、实验器材：
体视镜，显微注射仪，28.5℃恒温水浴设备，37℃恒温水浴锅，PH值测定仪，水平拉针仪，斑马鱼养殖设备（加热棒，曝气设备）等。培养皿（中号，大号），胶头滴管若干，移液枪。
2、溶液及配制：
（1）1×PBS: 将20×PBS用双蒸水稀释20倍，高温高压灭菌，室温放置备用。使用前调节至28.5℃。
（2）0.25%胰蛋白酶：准确称取0.5g胰蛋白酶，0.02g EDTA溶于200ml的1×PBS，37℃水浴充分溶解1h,4℃放置备用。使用前加热至28.5℃。
（3）1×Hank’s液: 称取0.4gKCl, 8.0gNaCl, 0.67g Na2HPO4·7H2O, 0.6g KH2PO4,  1.44gCaCl2, 1.23g MgSO4·7H2O, 溶于800ml蒸馏水中，充分溶解。使用前加入0.35g NaHCO3，加水定容至1L，用HCl调至pH 7.2，4℃保存。用于斑马鱼胚胎培养时加热至28.5℃，并加入抗生素（10万单位/升的氨苄青霉素，5万单位/升的氯霉素）。
3、注射样品准备：
以BstXI单酶切后的pcs107+zfβ-catenin-2 ORF 线性质粒为模板，用Ambion的体外转录试剂盒mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit 转录全长的β-catenin-2 capped mRNA。随后使用Roche公司的Mini Quick RNA Columns 纯化 capped mRNA。检测合成的RNA的质量和浓度后，-80℃保存，备用。使用DEPC水前将β-catenin-2 capped mRNA 稀释至所需浓度（400-600ng/μl），冰上放置。
三、实验步骤：
1、斑马鱼胚胎的获得
斑马鱼在实验室条件下至于28.5℃恒温水浴养殖，以高蛋白冰血赤虫和固体饲料作饵食，设置光照周期为10h黑暗/14h光照，性成熟后按雌雄分开养殖。催产前一天晚上，挑选2：1比例的雄鱼和预产卵雌鱼分开养殖，按照光照周期次日开始光照后雌雄混合，光照刺激15分钟左右即可开始收集受精卵。
2、斑马鱼胚胎受精膜的去除
斑马鱼卵子受精后几分钟，受精卵外围会举起一层受精膜保护胚胎，受精膜的存在不影响观察胚胎发育和模式形成，但不利于显微注射及其它后续实验，所以部分胚胎可以先利用胰蛋白酶脱膜。
在开始光照刺激产卵前1小时前，将4℃中的0.1x Hank’s液，0.25%的胰蛋白酶以及1xPBS溶液取出，将其加热至28.5℃。将收集的斑马鱼受精卵立即放入1×PBS溶液中漂洗一次后，吸尽PBS溶液后加入 0.25%胰蛋白酶溶液，于28.5℃消化处理并在显微镜下实时观察脱膜情况。一般处理大约10 min后，大部分受精卵的卵膜被消化，立即将脱膜后的胚胎小心转移到新鲜的曝气水中漂洗4次以去除残留酶液。最后将胚胎放入盛有0.1×Hank’s液的培养皿中，28.5℃培养，用于注射或观察。
3、显微注射
使用日本Narishige公司的PN－30水平拉针器将毛细管拉成显微注射用针（拉针参数为heater:80，sub:50，main:56）。注射前将针尖在滤纸上轻轻划一下，形成一个断面以适合注射。用移液器将针内注满液体石蜡并将针安装显微注射仪上，排出一定体积的石蜡后将配制好的样品吸入到毛细管里，准备注射。胚胎脱膜后在1-2细胞期进行注射，注射体积设定为1.15nl/每胚胎。野生型对照组中每个胚胎注入同样体积的无菌水。
4、 胚胎培养
注射完成后将胚胎转入已加抗生素的0.1×Hank’s液中于28.5℃培养，去除未受精的胚胎，每隔2-3h换液一次。
四、胚胎发育观察和作业
1、从原肠期至器官发生期，在体视镜下进行观察野生型对照组和β-catenin-2 capped mRNA注射组胚胎发育和形体模式形成的差异。
2、在受精24h后统计二者中畸形胚胎和正常胚胎的比例，并在体视镜下拍照。
3、根据野生型对照组和实验组中胚胎形体的差异分析β-catenin-2过表达对胚胎形体模式形成的影响。
五、注意事项：
1、体外合成的capped mRNA容易降解，相关的离心管、吸头等需DPEC处理去除RNA酶后方可使用。吸样前后均需将RNA置于冰盒上。
2、脱膜处理不当及容造成卵损伤。因卵膜内的压力比膜外大，脱膜不充分时移动卵子会导致细胞质从破损处强行挤出而使卵子损坏。时间过长则胰蛋白酶会对胚胎的细胞膜造成损伤。因此必须在显微镜下实时监控脱膜的过程。待大部分胚胎的卵膜基本上被溶解的时候才开始进行漂洗。漂洗时操作要轻而快，脱膜后的胚胎必需保持在水中，一旦离开水或者在水的表面都会使受精卵立即崩解。