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发育生物学实验

实验三 基因表达研究的显微操作技术

来源：浙江大学生物学国家级实验教学示范中心

时间：2023-03-23 15:23:29

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一、实验目的
通过显微操作将目标基因的DNA或者RNA分子注射到受精卵中，以观察其对胚胎发育的影响。这种显微操作技术是研究基因在胚胎发育中功能的重要手段。本实验的目的是了解和掌握显微操作的基本技术。
二、实验器材和材料
显微注射仪，体视镜，200ul移液器，100ul移液器，2.5ul移液器，注射试剂，封口膜，注射专用器皿，注射针，拉针仪。
三、实验内容和程序
1、体视镜操作：体视镜操作主要是通过调整焦距以及两个目镜之间的距离来保证视野内出现清晰且立体的景象。
2、注射仪的操作：注射仪是由定量控制器，显微注射器，手动操作仪以及固定支架等部分组成的精密仪器（图3-1）。控制器参数设置界面如图3-2。定量控制器与电源、显微注射器等的接口如图3-3。
 
 
图3-1：显微操作系统
 
 
图3-2：定量控制器面板
Output 1-4对应的信号输出端口，绿灯亮表示相应端口有信号输出；
I/W 注射/吸样；
VOLUME SET预设的注射或者吸入注射针的样品体积；
VOLUME COUNTER 实际注射进胚胎或者吸入注射针的样品体积；
RATE设置的吸入或者注射速率；
DEVICE TYPE连接的仪器类型（本实验中设置为”K”）；
G/N/D 端口同时输出信号/不同时输出信号/禁用端口；
RUN/STOP 开始或者暂停工作。
 
 
 
图3-3定量控制器背面接口
POWER ON/OFF 开关；
RS232/FOOT SWITCH 外接控制器端口；
OUTPUT 信号输出端口，对应图2的OUTPUT 1-4。
 
 
手动操作仪主要用于控制注射针的移动和角度，操作方式如图3-4所示。
 
 
图3-4 手动操作仪操作示意图
 
注射针通过垫圈和电极保护套连接和固定到注射器上。
 
图3-5 电极保护套及将注射针固定到注射器上的垫圈
3、实验步骤
（1）通过斑马鱼人工催产准备胚胎（可以直接用受精卵，也可以用脱膜的受精卵）。
（2）注射针的准备：在斑马鱼产卵的同时组装注射针。注射针是用特制的电极毛细管用电热拉针器拉制而成，其尖细的前端是封闭的，在使用前需要截掉针尖前端的封闭部分；然后在显微镜下观察截断后针头的大小，选择有斜面（参考普通医用针头），大小合适实验需要的注射针。针头粗对受精卵的损害相对较大，但过细则容易造成堵塞。然后使用特制的移液器枪头向注射针内灌满石蜡。
（3）注射针的安装：卸下操作仪的电极保护套及三个垫圈后，将保护套及较大的黑色垫圈套按大头在上，小头在下的方向依次套在注射针上。其他两个垫圈按照黑在上，白在下的顺序套在注射器的推杆上。将注射针套入到注射器的推杆上（此步要小心操作，电极很脆弱，不能用力过度），然后将固定的电极保护套旋紧即完成注射针的安装。组装完成后，调整控制仪参数，先排出一定体积的石蜡（一般排2500nl）确保注射针的前端没有气泡。
（4）注射样品的吸取：用干净的滤纸除去针头的石蜡，剪取合适大小的封口膜，将注射用的试剂吸取数微升至封口膜上，在体视镜下开始吸样（吸取样品体积，速率要先设置好）。吸样结束后，先排除50-100nl的样品，再设置需要注射的参数。
（5）注射操作：将胚胎放置在注射专用器皿，并将待注射胚胎移动到视野内。调节手动操作仪的旋钮，将注射针头插入到胚胎的胚胎中后（插入角度以45-60°未佳），按定量控制器的注射按钮或者脚踏板将样品注入到胚胎中；约以秒钟后，调节手动操作仪的旋钮将注射针头从胚胎中拉出完成注射。然后移动注射器皿将第二个胚胎移植到注射针头下，进行下一次注射。（注射在没有脚踏板的情况下需要两个，一个人注射，另一个负责按定量控制仪以完成注射，期间可以交换操作，保证每个人都熟悉基本操作技术）。完成注射后，调整参数将电极收回，卸下注射针，关闭仪器并用玻璃保护罩罩住。
四、注意事项：
1、实验前需要先熟悉仪器，在老师指导下进行操作练习。只有经过长期练习才能熟练使用显微注射仪。刚开始做尽力做到能将样品送到胚胎内部，可以通过共注射有颜色的试剂（如酚红之类）来第一时间观察样品是否进入胚胎。之后再尽量尝试把样品注入胚盘，再然后就是同时提高注射的速度和精度。
2、针头的大小应根据实验需要进行选择。
3、尽量能在1-2细胞期将样品注入到胚盘。由于鱼类的胚胎在16细胞以前，细胞与细胞之间的细胞质是连通的，只要将样品送入胚盘都是有效果。但是实际注射时，时期越早越好，最晚在分裂到8细胞就停止注射。