【实验目的】

掌握质粒DNA的抽提技术，学习琼脂糖凝胶电泳电泳的操作方法和技术

【主要仪器】

1．恒温培养箱          

2．恒温摇床

3．高压灭菌锅                 

4．台式离心机

5．干式恒温器              

6．振荡器；

7．电泳仪及电泳槽

8．紫外检测仪

【实验材料及试剂】

1．含重组质粒菌种

2．LB液体培养基 

3． 氨苄青霉素：100mg/ml，

4． 溶液Ⅰ，

5．溶液Ⅱ，

6 .溶液Ⅲ ，

7 ..酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），

8 .无水乙醇，70%乙醇

9. TE缓冲液（pH 8. 0），

10. RNaseA（1mg/ml），

11. 0.5×TBE缓冲液（pH8.0），

12. 琼脂糖，

13. 6×加样缓冲液，

14 . 1mg/ml溴化乙锭（EB），

【实验内容】

一、收集菌体

（1） 取1ml的过夜培养菌液加入1.5ml离心管中，8000r/min离心1min

（2） 弃上清液， 保留菌体沉淀，将管倒置于滤纸上数分钟，使液体尽可能流尽。

（3） 收集菌体沉淀，用旋涡混合器将菌体重悬浮于100ul溶液Ⅰ(TEG缓冲溶液，含溶菌酶)中，冰浴放置10min。

（4） 加入200 ul新鲜配置的碱裂解液（溶液Ⅱ）迅速盖紧管盖轻轻颠倒数次（不可振荡！！），混匀内容物并使之变清，冰浴放置5min。

二、分离纯化质粒DNA

（1）加入150 ul冰冷却的乙酸钾溶液（溶液Ⅲ），加盖迅速轻轻颠倒数次（不可振荡），混合均匀，冰浴放置10min，使沉淀完全。12000 rpm，4℃下离心10min。

（2）上清液移入另一干净离心管中，加等体积的（试剂取下层）酚/氯仿（1：1）反复振荡（约20次），混匀后，12000 rpm，4℃下 离心10min。

（3）上清液移入另一干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后于室温放置20 min。

（4）12000 rpm，4℃下 离心10min，弃上清液，将管口打开，倒置于滤纸上使所有液体尽可能流出。

（5）       加入1ml 70%乙醇稍洗沉淀一次（动作要轻，也可离心）。

（6）       弃上清液，打开管口，倒置于滤纸上使所有液体流尽 ，室温干燥15 min。

（7）       将沉淀溶于30 ul（或40 ul） TE缓冲液（pH8.0，含20mg/LRNase）中，置37℃恒温水浴中保温30 min（可于-20℃保存备用）。

    三、琼脂糖凝胶电泳
（1）制胶（1％琼脂糖凝胶实验室已制备）

（2）加样

           取5ul纯化的质粒DNA样品，与1ul 6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。

（3）电泳

          加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到100V，恒压电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约2cm时，停止电泳。

（4）观察和拍照

        取出胶块置于紫外灯下观察，DNA存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带，用凝胶成像仪进行拍照。

【实验记录与报告】

        分析质粒DNA电泳检测结果。

【实验思考题】

        在提取质粒DNA的过程中，EDTA、 SDS、 NaOH、乙酸钾、酚-氯仿-异戊醇等试剂的作用是什么？