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生物化学及实验(丙)

蔗糖酶分离纯化产物的SDS－PAGE检测分析及蛋白质相对分子质量测定

来源：浙江大学生物学国家级实验教学示范中心

时间：2023-03-22 23:26:15

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【实验目的】
   1.  掌握SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理和操作方法。
 2. 学习测定蛋白质相对分子质量(Mr)的方法
 
【主要仪器】
1. 电泳仪、垂直电泳槽及配件（长短玻璃板各1块、封胶条2条、梳子1个）
2．微量移液器：1000μl、200μl、10μl
3. 高速台式离心机
4. 脱色摇床
5. 恒温水浴100℃
 
【实验材料及试剂】
1. 标准蛋白质（1mg/1ml）
2. 自提蔗糖酶样品

【实验内容】
 1. 正确装好电泳槽内的胶板模具
 2. SDS—聚丙烯酰胺凝胶的制备
A、12%分离胶：                                  
30.8%凝胶母液               3.0ml
Tris—HCl缓冲液（pH8.9)     0.9ml
蒸馏水                      3.5 ml
10%SDS                      75ul 
10% AP（过硫酸铵）          60 ul,
TEMED（原装）               4 ul
10%AP及TEMED待装板成功后再加入上述溶液中,以免凝胶凝固影响灌胶。
将以上贮液混匀, 灌胶，水封，聚合（40min左右）。
              
      注意： 装板的方法；
              灌胶时小心不要有气泡；
              水封用滴管从一角慢加；
              除去水分时用无毛边的滤纸条轻吸残留的水液。
 B、4%浓缩胶：    30.8%凝胶母液                0.35ml
Tris—HCl缓冲液（pH6.7)      0.3ml 
蒸馏水                      2.3 ml
10%SDS                     25 ul
10% AP                      25 ul,
                  TEMED                      3 ul
 将以上贮液混匀, 灌胶，加至距玻璃边缘0.1cm时，轻轻插上“梳子”，聚合约30min后小心拔出梳子，电泳前将模具下端两角打开。
 
3.蛋白质样品的处理：
    ① 标准蛋白质（1mg/1ml）：使用前100℃沸水浴3min。
② 取4支Eeppendorf小离心管，编号。将4种样品分别加样品溶解液按以下比例配制,
           样品 ：样品溶解液（2X或5X内含1%SDS、1%巯基乙醇、10%甘油、0.02%溴酚蓝的0.01mol/L pH8.0Tris—HCl缓冲液。）
                  F1   ：样品溶解液 ＝   1 ：10
                  F2   ：样品溶解液 ＝   1 ：10
                  F3   ：样品溶解液 ＝   1 ：8
                  F4   ：样品溶解液 ＝   4 ：1（200 μl ：50 μl ）
     待混匀后，置100℃水浴箱中保温5min，取出冷却至室温。上样前离心5000rpm   6min
 
3．加样：    用移液枪吸取标准蛋白质液15ul加样（靠两边的第一个孔点试验品，不要点标准Marker）。样品上样量为15—20ul。
 
4.电泳：
          连接正极和负极，打开电泳仪，调电压150V ，电流20mA，电泳1.5 hr左右，待溴酚蓝指示剂迁移至凝胶下端的边缘约0.5—1cm处停止电泳。
 
5.剥胶和固定：
      取下凝胶模具，平放，揭开上层玻璃板，用剥胶器对溴酚蓝条带作一记号，以便相对迁移率的计算，并小心取下凝胶片，放入有固定液的大培养皿中，贴上标签。0.15小时。
 
6. 染色：
      弃去固定液，加入染色液，染色0.5 hr。
7. 脱色：
     除去染色液，加入脱色液。换脱色液2—3次，直至凝胶的蓝色背景褪去、蛋白质色带清晰为止（过夜）。
 
五、实验结果及分析
      列出电泳后各种蛋白的迁移率和分子量，从相对迁移率（样品迁移距离/染料迁移距离），对logMr作图（以logMr为纵坐标，以各种蛋白质的相对迁移率为横坐标）。利用样品的相对迁移率，从标准曲线上求出样品的分子量。画出SDS—凝胶电泳图谱。
 
【实验记录与报告】