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生物化学及实验(丙)

蔗糖酶蛋白含量及酶活力测定的测定

来源：浙江大学生物学国家级实验教学示范中心

时间：2023-03-22 23:29:14

阅读：317次

实验目的】

1． 掌握酶活力测定的方法；

2． 学会用Folin-酚法测定蛋白质的浓度；

3． 熟悉酶活力及蛋白浓度的计算方法。

 

【主要仪器】

1、恒温水浴（25℃、100℃）；

2、可见光分光光度计、1cm玻璃比色皿；

3、试管、试管架；

4、移液管；

5、微量移液枪 200ul,1000ul;

 

【材料与试剂】

1. 蔗糖酶样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ

2. 3,5－二硝基水杨酸试剂

3. 1g/L葡萄糖标准溶液(葡萄糖相对分子量198.17）

4. 5％蔗糖溶液

5. 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5；

 

【实验内容】

1.蔗糖酶的酶活力测定

（1）标准曲线的制作            

取9支试管，按下表加入试剂：

      管号

试剂

1

2

3

4

5

6

7

8

9

葡萄糖1g/L（ml）

0.00

0.05

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

蒸馏水 (ml)

2.0

1.95

1.90

1.80

1.70

1.60

1.50

1.40

1.30

3,5-二硝基水杨酸(ml)

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

       各管溶液混合均匀，沸水浴中加热5min。取出立即用冷水冷却至室温，再向每管加入7ml蒸馏水，摇匀，于520nm处测A值.

 

 

A520

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A520平均值

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

以还原糖(mg数)为横坐标，A520值为纵坐标制作标准曲线。

 

（2）       各步酶活力的测定：按下表加样反应（单位：ml）

编号

样品

空白

 1

 Ⅰ(1：50)

 Ⅱ(1：50)

 Ⅲ(1：50)

 Ⅳ(1：10)

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

乙酸

缓冲液

 0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

蔗糖0.5mol/L

 0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4  

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

蒸馏水

 

 1.2

1.15

1.0

0.7

1.15

1.0

0.7

1.15

1.0

0.7

1.15

1.0

0.7

酶液

 

 0.0

0.05

0.2

0.5

0.05

0.2

0.5

0.05

0.2

0.5

0.05

0.2

0.5

各管溶液混合均匀, 25℃ 保温10分钟。然后向每管加入1.0ml 3.5-二硝基水杨酸试剂，沸水中加热5分钟，取出后立即用冷水冷却至室温，再向每管加入7ml蒸馏水，摇匀，测OD520值。

A520

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

葡萄糖μmol

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

活力

（u/ml）

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

活力平均值

 

 

 

 

 

 

 

2．蛋白含量测定

(1)标准曲线制作：(Folin-酚法)

用Tris-HCl缓冲液配制成500ug/ml 牛血清清蛋白(B.S.A)溶液(老师已配制)，按下表加样：

          管号 

   试剂

 1

 2

 3

 4

 5

 6

牛血清清蛋白 (ml)

 0.0

 0.1

0.2

 0.3

 0.4

 0.5

 蒸馏 水    (ml)    

 0.5

 0.4

0.3

 0.2

 0.1

 0.0

 Folin A    (ml)

 5.0

 5.0

5.0

 5.0

 5.0

 5.0

   保温时间

                25℃   10分钟

 Folin B    (ml)

 0.5

 0.5

 0.5

 0.5

 0.5

 0.5

   保温时间

                 25℃   10分钟

    A500值

 

 

 

 

 

 

以蛋白质mg 数为横坐标，A500值为纵坐标制作标准曲线。

 

 

（2）各步骤酶液的蛋白含量测定：按下表加样(ml)

   编号

试剂

空白

 Ⅰ(1:6稀释)

 Ⅱ(1:6)

   Ⅲ(1:6)

 Ⅳ(原液)

 1

 2    3    4

 5    6   7

 8    9    10

11    12 13

酶 液

 0.0

0.05 0.2 0.5

0.05 0.2 0.5

0.05 0.2 0.5

0.05 0.2 0.5

蒸馏水

 0.5

0.45 0.3 0.0

0.45 0.3 0.0

0.45 0.3 0.0

0.45 0.3 0.0

Folin A

 5.0

5.0   5.0 5.0

5.0   5.0 5.0

5.0   5.0 5.0

5.0   5.0 5.0

保 温

25℃      10分钟

Folin B

 0.5

0.5   0.5 0.5

0.5   0.5 0.5

0.5   0.5 0.5

0.5   0.5 0.5

保 温

25℃      10分钟

A500

 

 

 

 

 

蛋白质/mg

 

 

 

 

 

蛋白质浓度mg/ ml

 

 

 

 

 

蛋白质浓度平均值

 

 

 

 

 

 

3.实验结果

活力和比活力的计算：

1活力单位(U)：酶在一定温度、pH4.5的条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需的酶量。

比活力=总活力单位u／总蛋白mg

 

根据测得结果，计算出各步数据填入下表：

Fraction

体积(ml)

蛋白(mg/ml)

总蛋白

(mg)

活力 (u/ml)

总活力

(u)

比活力(u/mg)

纯化倍数

回收率

(%)

Ⅰ

 

 

 

 

 

 

1

100

Ⅱ

 

 

 

 

 

 

 

 

Ⅲ

 

 

 

 

 

 

 

 

Ⅳ

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

【实验记录与报告】