【实验目的】
1 . 了解离子交换层析的基本原理。

2 . 掌握蔗糖酶的提取纯化及离子交换层析的操作方法。

3 . 熟悉有关生化技术的基本操作。

【主要仪器】

1. 高速冷冻离心机

2．层析柱（φ1.0×20㎝ ）(

3、恒流泵（流速0.8～1ml/min）

4、梯度混合器(100ml梯度杯)

5、核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A）

6、记录仪（纸速：0.5mm/min；灵敏度：50mV）

7、部分收集器及收集试管（4ml/管）

【实验材料与试剂】

1. 蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ

 2. DEAE-Sepharose Fast Flow (弱碱性阴离子交换剂)

 3. 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液

4. 20mmol/L Tris-HCl，（1mol/L NaCl） pH7.3缓冲液

 5. 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5

 6. 5%蔗糖溶液

 7. 3，5-二硝基水杨酸试剂

【实验内容】
1. 离子交换剂准备：(实验室已准备好）
    取适量DEAE-Sepharose，加入0.5mol/L NaOH溶液，轻轻搅拌，浸泡0.5小时，用布氏漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加 50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中性，（DEAE-Sepharose Fast Flow，用后务必回收）。浸入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液中平衡备用。

2. 装柱(层析柱规格1×20cm)：   

 装柱前先将柱下端的出水口关闭，加进5ml（约1/3柱床体积） 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液，然后将处理好的DEAE-Sepharose FF轻轻搅匀（注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱内。注意不能带进气泡，待凝胶沉积约1-2cm后松开层析柱出口，控制流速0.5ml/min；待柱内DEAE-Sepharose FF自然沉降至所需高度并分出水层后，吸去水层，用玻棒将沉降界面搅匀，再加进处理好的DEAE-Sepharose FF至距层析柱上端4cm处为止（这时须保持DEAE-Sepharose FF柱面平整）。用 50ml 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液装进洗脱杯，连通层析柱，进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pH一致。

DEAE-Sepharose FF柱预先用20mmol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 平衡(约30ml流出液即可)，以流出液pH 与 buff 一致为准。上样后，用20 m mol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 进行NaCl梯度洗脱(NaCl 为0.5mol/L),层析柱连上梯度混合器，混合器中分别为50ml、20mmol/L Tris-HCl, pH7.3缓冲液；50ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液 (其中含0.5mol/L NaCl)。

3. 加样，洗脱：

将平衡好的DEAE-Sepharose FF上端的水小心吸干，留下一薄层液面，用长滴管将样品液5 ml，沿管壁环形慢慢加进柱内，待样品液全部进入DEAE-Sepharose FF内，只剩下一薄层液面时，用buff环形缓慢填满层析柱，

立即连上梯度洗脱杯（梯度洗脱杯中靠出口处的杯中装20mmol/L Tris-HCl pH7.3 buff 50ml，另一杯中装50ml buff含0.5mol/LNaCl），打开洗脱杯控制开关，开动磁力搅拌器，用蠕动泵控制流速为3 ml/ 15min。

洗脱液通过检测器，用部分收集器自动收集洗脱液，每6 min收集一管(约3~4ml)。洗脱至混合器中液体流完为止，比较各管的酶活力的大小，将最高活力的若干管酶液集中，均分在几个小管中，低温保存，用于性质测定。留液(Ⅳ)测定酶活和蛋白量。

4.酶活力检测：

取试管若干支编号，各加入0.5mL 5%蔗糖（pH4.6），每隔一管取100uL收集液，按先后顺序分别加入上述含0.5mL 5%的蔗糖的试管中混匀，置50℃水浴10min。再加入0.5mL 3,5-二硝基水杨酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，直接目测。即可确定酶活力高峰范围。将酶活力较高的各管收集于离心管内，并个性标明。

5.保存
收集活力高的蔗糖酶液，测量并记录总体积ml数（样品Ⅳ），-20℃保存备用，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析

【实验记录与报告】

以样品浓度（A₂₈₀）为纵坐标，以洗脱体积（ml）为横坐标作图。