【实验目的】

  掌握蔗糖酶的提取纯化的操作方法。

  熟悉有关生化技术的基本操作。

【实验仪器】

  1. 冷冻离心机

  2. 研钵

  3. 恒温水浴箱

  4. 20℃冰箱

【实验材料及试剂】

  1 . 市售酵母粉        .

  2. 石英砂20mmol/LpH7.3Tris-HCl缓冲溶液（以下简称buff）

  3. 20mmol/LpH7.3Tris-HCl缓冲溶液（以下简称buff）

  4. 95％乙醇

【实验内容】

  1. 细胞的破碎   称取12.0克干酵母粉于研钵内，加3.0克石英砂， 仔细研磨至所有材料成细粉末时，加入10ml buff（先量取总体积buff40 ml）在研钵内继续研磨成糊状，约10分钟，再分次加buff 10ml并研磨10分钟，, 研磨时间大约60分钟。转入50mL离心管，12000r/min离心10分钟，收集上清液，量取并记录体积，留存1.0ml 上清液置Eeppendorf小离心管内(定为第一步骤的样品Ⅰ，贴上标签)，用于后续实验（测定酶活力和蛋白浓度等等）。

  2.  热处理    将上步所得上清液转入50 ml离心管，迅速放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃棒温和搅动抽提液，迅速用冰浴冷却，10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，量取并记录上清液体积，留存1.0ml (样品Ⅱ)测定此酶活力和蛋白浓度等等。

  3. 酒精沉淀     将上清液加入相同体积的-20℃95％乙醇，冰浴中温和搅动，（注意边搅慢加，滴加乙醇时滴与滴之间不能连成线！！！）放置30min，然后10000rpm离心10min，弃去上清液，将沉淀溶于10ml 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3 buff，一定要混合均匀！！！(样品Ⅲ，另留存1.0 ml样液测酶活和蛋白浓度)，上样前用10ml离心管5000rpm离心10min，待上样。

【实验记录与报告】

   记录每一步得到的粗酶提取液的体积，以便蔗糖酶活力和蛋白浓度的计算。

【实验思考题】

   蛋白质样品的提取方法有哪些？蔗糖酶提取的实验关键是什么？