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生物化学实验技...

蔗糖酶活性染色

来源：浙江大学生物学国家级实验教学示范中心

时间：2023-04-10 16:48:39

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【实验目的】
   1. 学习SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)的基本原理和操作方法
   2. 蔗糖酶分离纯化产物的SDS－PAGE检测分析
   3. 学习测定蛋白质相对分子质量(Mr)的方法

【实验内容】
1. 准备电泳装置：电泳槽、电泳仪。
2. 配胶及凝胶的制备
（1）配制凝胶：

	12%分离胶所需试剂量(ml)	5%浓缩胶所需试剂量(ml)
30.8%凝胶贮液	3	0.35
3mol/LTris-HCL pH8.9 分离胶缓冲液	0.95
0.5mol/L Tris-HCL pH6.7 浓缩胶缓冲液		0.32
10% SDS	0.075	0.025
TEMED	0.003	0.003
蒸馏水	3.42	1.8
10% Ap	0.035	0.020
总体积(ml)	7.5	2.5

注：1、为去除抑制胶聚合的氧，加入AP前可进行抽气处理；2、过硫酸铵和TEMED的量应根据室温或聚合情况而定（凝胶聚合时间控制在30～40分钟）。

（2）、凝胶板的制备
① 分离胶的制备：
       按上表配制7.5ml分离胶，混合均匀后凝胶液加入长、短玻璃板间的缝隙内至适当高度，再用少许蒸馏水（或水饱和的异丙醇或正丁醇）沿长玻璃板板壁缓慢注入，约5mm高，以封住胶面，以促使聚合并使胶面平直，约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合，倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余的水分。
② 浓缩胶的制备：
       按上表配制2.5ml浓缩胶，混匀后加到已聚合的分离胶上方，直至离短玻璃板上得约1mm处，轻轻将样品槽模板（梳子）插入浓缩胶内，约10min后凝胶聚合，再放置20～30min，使凝胶“老化”。将电泳缓冲液倒入上、下贮槽中（电泳缓冲液应没过短板约0.5cm以上），小心拔去样品槽的槽板（梳子），用滴管轻轻吹打样品凹槽中多余的未凝固的胶残液，即可准备加样。
3. 样品处理与加样
（1）样品制备
      取蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）各50ul（样品浓度约2～5mg/ml) ，分别放入1.5ml离心管中，10000r/min离心10min,收集上清为样品溶液。
（2）样品处理
       将样品溶液分别按等体积加入“2×蛋白质样品溶解液”，100℃保温3分钟，取出冷却后，10000r/min离心5min,取上清直接加样。
（3）加样
       用微量注射器向样品槽内注入10～20μl样品混合液(每孔蛋白质上样量在20～40μg）。如样品浓度较低，可适当增加上样量。
       蛋白质分子量标准溶液加10μl/孔。
4. 电泳
      将电泳槽盖子盖上，上槽（加样孔端）接负极、下槽接正极，连接电泳仪电源，电流控制在2～3mA/样品孔，一般样品进浓缩胶前，电流控制在10～20mA，待样品进分离胶后，将电流调到20～30mA，保持电流强度不变（恒流），待指示染料迁移至下沿约0.5～1cm处停止电泳。
5. 剥胶、固定和染色
       电泳结束后，取下凝胶模，用专用铲子撬开玻璃板，将底部凝胶一角切下做一加样标记，将凝胶板放在￠15cm培养皿内，加入染色液，固定、染色30min左右，
6. 脱色
       弃去染色液，加入蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰为止。
7. 实验结果
（1）计算蛋白质样品相对分子质量
       将￠15cm培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距溴酚蓝区带中心间的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端(凝胶顶端)的距离（cm），按下式计算相对迁移率R_f
                            相对迁移率R_f＝蛋白样品距分离胶顶端距离(cm)/溴酚蓝区带中心距分离胶顶端距离(cm)

       列出电泳后各种蛋白质的迁移率和分子量。
       以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子质量lgM为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。根据蛋白质样品的相对迁移率可直接在标准曲线上查出其相对分子质量。
   蛋白质样品相对分子质量（Mr)＝

（2）SDS－PAGE图谱拍照记录

（3）作标准蛋白质相对分子量的对数与电泳相对迁移率标准曲线图