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生物化学实验技...

蔗糖酶提取

来源：浙江大学生物学国家级实验教学示范中心

时间：2023-04-10 16:25:32

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【实验目的】
    掌握蛋白质提取的方法；学习蛋白质的分级沉淀。
【实验内容】
1. 酵母细胞破碎
    称取市售干酵母粉10g，约3g石英砂放入研钵中直接研磨至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积50ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲     液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃、12000r/min离心15分钟，收集上清液并量出体积V1（样品I）,另留1ml上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析。
2. 热处理：
    将上一步抽提液（样品I），迅速放入50℃恒温水浴中，保温30分钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液，保温后迅速用冰浴冷却5分钟，转移至两支50ml离心管中，平衡后， 4℃，15000r/min离心15分钟，收集上清液并量出上清液体积V2（样品Ⅱ），另留1ml上清液（样品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。
3. 有机溶剂（乙醇）沉淀：
    将热处理后的上清液加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，至少放置30分钟，然后转移至两支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃，12000r/min离心10分钟，弃去上清液，沉淀放置－20℃冰箱保存，以备用于下周实验——实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶。
 
【实验记录与报告】
   
【实验思考题】
    本实验在从干酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的过程中具体运用了哪些方法？你认为还有哪些方法可以运用？说说你的设想。