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生物化学实验（乙）

离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶

来源：浙江大学生物学国家级实验教学示范中心

时间：2023-04-10 16:32:17

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【实验目的】
    1. 学习离子交换层析的基本原理；
    2. 学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；
    3. 学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。
【实验内容】
1. 离子交换剂准备：(实验室已准备好）
    取适量DEAE-Sepharose，加入0.5mol/L NaOH溶液，轻轻搅拌，浸泡0.5小时，用布氏漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加 50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中性，（DEAE-Sepharose Fast Flow，用后务必回收）。浸入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液中平衡备用。
     
2. 样品处理
    将乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白样品充分溶解于15ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；4℃ 15000r/min, 离心10分钟，收集样品上清液（样品Ⅲ）测量总体积(ml数），留取1ml（样品Ⅲ）用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力的测定以及用于SDS-PAGE分析；将其余样品（样品Ⅲ）作离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶(可先取50ul酶液做酶活力检测）。
3. 纯化检测仪器连接
   将梯度混合器(100ml梯度杯)，层析柱（φ1.0×20㎝ ），恒流泵 (10rpm) （流速0.8～1ml/min），核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A），记录仪（纸速：0.5mm/min，50mV）、部分收集器（4～5 ml/管/5min）等按要求连接并设置好
4. 装柱(层析柱规格1×20cm)、平衡     
    装柱前先调好流速0.8ml～1ml/min，然后将柱下端的出水口关闭，加进5ml（约1/3柱床体积）  20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液，然后将处理好的DEAE-Sepharose Fast Flow，轻轻搅匀（注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱内至层析柱上端。注意不能带进气泡，待凝胶自然沉积离柱管上端约1-2cm后松开层析柱出口，控制流速 0.8ml～1ml/min；待柱内DEAE -Sepharose Fast Flow 凝胶沉降至稳定高度并分出水层后，吸去水层，用玻棒将沉降界面搅匀，再补加处理好的DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶，直到凝胶沉降至稳定高度距层析柱上端约3cm处为止（这时须保持DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶柱面平整）。用20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液连通层析柱，进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pH一致。
5. 加样
    停止加入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时，恒流泵停止工作。用胶头滴管缓慢将蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。打开恒流泵，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加洗脱缓冲液至一定高度。
6. 洗脱：
梯度洗脱法：
    加样后，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液进行平衡，洗脱流速为0.8ml～1ml/min，洗去未被DEAE -Sepharose Fast Flow凝胶吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液NaCl梯度洗脱（浓度为0-1mol/L NaCl ），层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为50ml 0.05mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液和50ml含1mol/L NaCl的0.05ml/L Tris-HCl  pH7.3缓冲液。洗脱流速为0.8～1ml/min，每4ml接一管，洗脱至缓冲溶液流完为止。跟踪测定各管的蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，测量总体积（ml数）（样品Ⅳ），并留样用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定、SDS-PAGE分析、酶的基本性质实验和用于“用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响”（半自主性设计实验） ，样品－20℃低温保存备用。
7. 蔗糖酶活力检测
 
 
 
 空白对照样品管
0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.50.5ml0.5ml
5%蔗糖溶液0.5ml0.5ml
蒸馏水1.0ml0.9ml
分离纯化样品溶液/0.01ml
  50℃水浴10min
3.5－二硝基水杨酸试剂0.5ml0.5ml
  100℃水浴5min
蒸馏水5ml5ml
观察颜色  
 
8. 保存
    收集活力高的蔗糖酶液，测量总体积(ml数) （样品Ⅳ），-20℃保存备用，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析以及用于用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响（半自主性设计实验）。
 
 
【实验记录与报告】