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生物化学实验（I）

纯化方案的评价

来源：浙江大学生物学国家级实验教学示范中心

时间：2023-03-23 15:08:40

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实验目的】
    1. 学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；
    2. 掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量；
    3. 掌握分光光度计的使用方法。
    4. 掌握酶活力测定的基本原理和方法；
    5. 学习酶的比活力的计算。

【实验内容】
一、Folin-酚法测定蛋白质含量
1. 制备Folin-酚法蛋白质标准曲线
    取6支试管，编号1－6，按表1顺序依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A500nm值）。
       
试管号123456
0.5g/L标准蛋白质溶液（ml）00.20.40.60.81
蒸馏水   （ml）10.80.60.40.20
Folin-酚试剂甲 （ml）555555
 混匀，在室温(25℃）下静置10 min
Folin-酚试剂乙 （ml）0.50.50.50.50.50.5
 混匀，在室温下静置20min
A500nm      

2. 各步分离纯化的蔗糖酶蛋白测定
    由于蔗糖酶提取、分离纯化的各个样品的蔗糖酶蛋白质含量较高，因此在测蔗糖酶提取分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ的蔗糖酶蛋白质含量以前，可根据各样品溶液的蔗糖酶蛋白质含量高低不同作适当的稀释，以测定蔗糖酶蛋白质含量A500nm值在蛋白质含量标准曲线范围以内为宜。
   取13支试管，编号1～13，按表2依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A500nm值）。 
样 品空白I(1:4稀释)Ⅱ(1:4稀释)Ⅲ(1:4稀释)Ⅳ(原液)
编 号12345678910111213
样品液V(ml)0.00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.5
水(ml)1.00.950.80.50.950.80.50.950.80.50.950.80.5
Folin－酚甲试剂(ml)5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0
 混匀后，室温（25 ℃ ）放置10分钟
Folin－酚乙试剂(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5
 混匀后，室温（25℃ ）放置20分钟
A500nm0            

3. 3、绘制标准曲线并计算
⑴  绘制标准曲线：
    以光吸收值（A500nm）为纵坐标，标准蛋白质含量（mg/L）为横坐标，在坐标纸上绘制蛋白质标准曲线。
⑵  计算：
    蔗糖酶提取分离纯化的样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ稀释溶液的光吸收值（A500nm），查蛋白质标准曲线得蔗糖酶蛋白含量，再进行样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ溶液的最终蔗糖酶蛋白含量的计算。
二、蔗糖酶活力测定——3，5－二硝基水杨酸法
1.标准曲线的制作
   按下表加操作：
 
 1234567
葡萄糖(umol/L)01.01.52.02.53.03.5
1g/L葡萄糖标准溶液（ml）0.000.200.300.400.500.600.70
H2O （ml）2.01.801.701.601.501.401.30
3.5－二硝基水杨酸 (ml)1.01.01.01.01.01.01.0
                     将各管溶液混匀后，在100℃恒温水浴加热5分钟，
                  取出立即用冷水冷却至室温  
H2O（ml）7777777
             将各管溶液混匀
A520nm       
    以还原糖（mg数）为横坐标，A520值为纵坐标，制作葡萄糖浓度－吸光值标准曲线。 
2. 蔗糖酶的酶活力测定
按下表加样：

 
样 品空白I(1:200稀释)Ⅱ(1:200稀释)Ⅲ(1:200稀释)Ⅳ(1:50)
编 号12345678910111213
0.2mol/L乙酸缓冲液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5
H2O(ml)1.00.950.80.50.950.80.50.950.80.50.950.80.5
蔗糖酶液(ml)0.00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.5
5％蔗糖溶液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5
保温时间立即混匀后，50℃ 保温10分钟
3.5－二硝基水杨酸试剂(ml)1111111111111
 在100℃恒温水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却至室温  
蒸馏水7777777777777
 混匀
A520nm             
三、分离效果的评价
1. 蔗糖酶活力和比活力的计算：
2. 蔗糖酶各步纯化样品的纯度比较
  
  
 体 积(ml)蛋白浓度(mg/ml)总蛋白(mg)蛋白回收率（%）活 力(u/ml)总活力（u）酶活回收率（%）比活力（u/mg）纯化倍数
样品Ⅰ  100%   100% 1
样品Ⅱ         
样品Ⅲ         
样品Ⅳ         

【实验记录与报告】