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生物化学实验（I）

正交法确定蔗糖酶酶的最适反应条件

来源：浙江大学生物学国家级实验教学示范中心

时间：2023-03-23 15:55:39

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【实验目的】
1. 初步掌握正交试验设计法的使用。
2. 运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度和pH值这四种因素对酶活

【实验内容】
1. 实验设计
（1）确定试验因素和水平
本实验取四个因素，即底物浓度[S]、酶浓度[E]、温度、pH值。每个因素选三个水平，实验因素和选用水平如表1。

因素水平	[S] （ml）	[E] （ml）	温度（℃）	pH
1	0.5	1.0	50	3.6
2	0.2	0.6	37	5.6
3	0.8	0.2	65	4.6

    作因素、水平表时，各因素的水平，最好不要按大小顺序排列。按一般方法，如对四个因素三个水平的各种搭配都要考虑，共需做34=81次试验，而用正交表只需做9次试验。
（2）选择合适的正交表
    合适的正交表，是指要考察的因素的自由度总和，应该不大于所选正交表的总自由度。
    正交表 Ln（ tq）
L —— 正交表的代号
n —— 处理数（试验次数）
t —— 水平数
q —— 因素数
试验次数 n = q( t–1 )+1= 4（3－1）+1＝9
总自由度 V总= n-1
各列自由度   V列 = K（该列水平数）–1
    例如本实验选用四个因素，每个因素选三个水平，四个因素各占一列，那么四个因素的自由度分别为：
V1 = 3–1 = 2， V2 = 3–1 = 2， V3 = 3–1 = 2， V4 = 3–1 = 2。
四个因素的自由度总和 = V1 + V2 + V3 + V4 = 8
因为各因素自由度总和是8，它没有超过L9（34）的总自由度= 9–1 = 8。所以选择正交表L9（34）是适合的。
（3）在所选的正交表上进行表头设计
    由于本实验是一项四因素各三水平的试验，这样将四个因素依次放在
L9（34）的第1，2，3，4列上，这项把因素放入正交表头的工作，叫做表头设计。见表2。正交表都应具有以下两个特性：
A. 在每一列中，各水平出现的次数相等。即在任何一列中，数字1和数字2和数字3都出现三次（几个水平就均出现几次）。
B. 任何两列中，横行组成的数对出现次数相等，均出现一次（这里有9个不同的数对，均出现一次）
（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、
（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，3），各出现一次。
    以上这些特点保证了用正交表安排的试验计划是均衡搭配的，因此分析数据比较方便，可进行综合比较，结果比较可靠。在所选的正交表上进行表头设计，见表2。

水平因素实验号	1 [S]	2 [E]	3 温度	4 pH
1	1	1	1	1
2	1	2	2	2
3	1	3	3	3
4	2	1	2	3
5	2	2	3	1
6	2	3	1	2
7	3	1	3	2
8	3	2	1	3
9	3	3	2	1

2、试验安排
将本实验的四个因素依次填入L9表的因素1，2，3，4中；再将各列的水平数用该列因素相应的水平写出来，便可得到下面的试验安排表（表3）。
表中试验号共9个，表示要做9次试验，每次试验的条件如每一纵行所示。如做第一个试验时[S]是0.5 ml，[E]是1.0mL，温度50℃，pH为3.6。第二个试验[S]是0.5ml，[E]是0.6mL，温度37℃，pH为5.6，余类推。

实验号试剂（ml）	2	4	9	1	6	8	3	5	7
5%蔗糖溶液[S]	0.5	0.2	0.8	0.5	0.2	0.8	0.5	0.2	0.8
0.2mol/L 乙酸缓冲溶液[pH]	pH5.6 1.0	pH4.6 1.0	pH3.6 1.0	pH3.6 1.0	pH5.6 1.0	pH4.6 1.0	pH4.6 1.0	pH3.6 1.0	pH5.6 1.0
蒸馏水	0.9	0.8	1.0	0.5	1.6	0.6	1.3	1.2	0.2
	37℃预温5min			50℃预温5min			65℃预温5min
蔗糖酶（样品Ⅳ）[E] (作相应的预温）	0.6	1.0	0.2	1.0	0.2	0.6	0.2	0.6	1.0
[温度]	37℃反应10min			50℃反应10min			65℃反应10min
DNS	1	1	1	1	1	1	1	1	1
	100℃保温5min，取出后立即用冷水冷却。
蒸馏水	5	5	5	5	5	5	5	5	5
A₅₂₀

另取试管一支作非酶对照，即加5%蔗糖溶液0.5ml，缓冲液1.9ml。先加DNS 1ml摇匀室温放置5分钟后再加入蔗糖酶（样品Ⅳ） 0.6ml摇匀室温放置10分钟，100℃×5min，再加入蒸馏水5ml，混匀后在520nm处测光密度值。
3. 试验结果及分析
实验做好后，把9个数据填入表4试验结果栏内，按表中数据计算出各因素的一水平试验结果总和、二水平试验结果总和、三水平试验结果总和，再取平均值（各自被3除）。最后计算极差。极差是指这一列中最好与最坏的之差，从极差的大小就可以看出那个因素对酶活力影响最大，那个影响最小。找出任何条件下酶活力最高。最后作一直观分析的结论。

水平因素实验号	1 [S](ml)	2 [E](ml)	3 温度(℃)	4 pH值	试验结果 A520
1	1 0.5	1 1.0	1 50	1 3.6
2	1 0.5	2 0.6	2 37	2 5.6
3	1 0.5	3 0.2	3 65	3 4.6
4	2 0.2	1 1.0	2 37	3 4.6
5	2 0.2	2 0.6	3 65	1 3.6
6	2 0.2	3 0.2	1 50	2 5.6
7	3 0.8	1 1.0	3 65	2 5.6
8	3 0.8	2 0.6	1 50	3 4.6
9	3 0.8	3 0.2	2 37	1 3.6
Ⅰ(一水平试验结果总和)
Ⅱ(二水平试验结果总和)
Ⅲ(三水平试验结果总和)
Ⅰ/3
Ⅱ/3
Ⅲ/3
级差

以OD值为纵座标，因素的水平数为横座标作图。
实验的典型结果与异常分析
试验确定的最佳条件与理论很吻合。如出现与理论明显不一致的现象可能是试验过程中如加样及时间控制
4. 注意事项
（1）各试剂加样一定要准确。
（2）保温时间各管要一致。
（3）加DNS后应立即摇匀。

【实验记录与报告】