PCR技术(三):Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是 一种嗜热真菌,能在70~
(一)酶活性与热稳定性
该酶基因全长2496个碱基,编码832个氨基酸,酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.75~80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸,
(二)离子依赖性
aqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶,该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感.以活性程度 很低的鲑鱼精子DNA为模板,dNTP的浓度为0.7~0.8mmol/L时,用不同浓度Mg2+进行 PCR反应10min,测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高,此浓度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性,Mg2+过高就抑制酶活性,当Mgcl2浓度在 10mmol/L时可抑制40~50%的酶活性.由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离 的Mg2+浓度,因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整,优化浓度.一般反应 中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.5~1.0mmol/L.适当浓度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高50~60%,其最适浓度为50mmol/L,高于75mmol/L时明显抑制该酶 的活性.
(三)忠实性
TaqDNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性,而无3'→5'外切活 性,它不具有Klenow酶的3'→5'校对活性.因而,在PCR反应中如发生某些碱基的错 配,该酶是没有校正功能的.Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.1×10-4.
(四)抑制剂
低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSD)对Taq DNA聚合酶的 催化活性并无影响.极低浓度的离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠(小于0.06%),十二烷 基肌氨酸钠(小于0.02%),十二烷基硫酸钠(SDS,小于0.01%)几乎可完全抑制该酶的 活性.而非离子表面活性剂在较高浓度(Tween20,NP-40.和Tritox-100)如>5%时方能 抑制该酶的活性.
变性剂对TaqDNA聚合酶活性的影响
变性剂 |
浓度 |
活性(%) |
乙醇 |
≤3% |
100 |
|
10% |
110 |
尿素 |
≤0.5mol/L |
100 |
|
1.0mol/L |
118 |
|
1.5mol/L |
107 |
|
2.0mol/L |
82 |
DMSO |
≤1% |
100 |
|
10% |
53 |
|
20% |
11 |
DMF |
≤5% |
100 |
|
10% |
82 |
|
20% |
17 |
甲酰胺 |
≤1% |
100 |
|
15% |
86 |
|
20% |
39 |
SDS |
0.001% |
105 |
|
0.01% |
10 |
|
0.1% |
〈0.1 |
低浓度的NP-40(0.05%)和Tween20(0.05%)能增强TaqDNA聚合酶的活性.低浓度SDS对 该酶的抑制作用可加入一定浓度的NP-40和Tween20抵消.TaqDNA聚合酶可在
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