熟练掌握Hungate厌氧操作技能，了解和掌握厌氧微生物的培养基配制，并进行分离纯化。

(一)、高纯无氧N₂的制备

1、  接通电源：把输出电压缓缓从0伏分级升到50～90伏之间（调电压的过程持续大约2-3s就可以了）。大约20分钟后，铜柱温度能达到350℃左右（输出电压禁止长时间超过90V以上，否则会导致铜玻璃柱变形直至破裂，甚至发生安全事故）。

2、  待铜柱温度升至350℃左右时，加热套触摸起来比较烫，开启氢气钢瓶并形成气流，使铜柱内的铜丝还原（反应速率很快，几秒钟见效，还原与否可以从铜丝颜色的变化看到，同时柱内会产生水蒸气，氧化铜与氢气反应所致；通氢气的时候最好打开窗户，一定熄灭操作台边上所有明火，包括酒精灯和电炉）。

3、  待铜丝被氢气还原呈现纯紫铜铮亮色，同时把里面的水蒸气也排出完全后，关闭氢气钢瓶，压力表指针降为零；打开氮气钢瓶，气流大小以把针头对准操作者手背5cm距离明显感觉到气流为宜，并随时注意气流是否足够。

4、  使用完毕后，先关紧氮气钢瓶，使压力表的指示针回至零位，接着关闭电源，使调压变压器调节指示回至0伏处。

(二)、无氧无菌水的配制

1.         将500ml一定浓度的NaCl水溶液（防止稀释时细胞涨破）沿玻璃棒倒入固定在铁架台上的1000ml圆底烧瓶中（选择合适的圆底烧瓶，水不可太满，否则水沸腾时容易溅出），最好放入几个防爆玻璃珠。向500ml水中加入终浓度为0.001‰的刃天青（resazurin），即加入0.5ml 的1‰刃天青母液（W/V），并加入0.25g半胱氨酸（L-Cysteine）(终浓度0.5‰)。在烧瓶外壁溶液水平面处划一刻度后，加入适量水（因为蒸发会损失部分水分）。煮沸5-10min（视所加水总量而定），刃天青会根据水中含氧量的下降经历紫色-红色-无色的颜色变化，当溶液变为无色后，再煮沸5min，然后通高纯氮气1-2min（赶走空气）。

2.         分装的过程可以不用继续加热，用10ml的定量注射针筒抽进氮气流，再打出（三次以上）洗气，然后抽取9ml无氧水注入已换气的15ml厌氧管中（抽取注射过程中应迅速利落，与空气接触时间应缩至最短）；注入厌氧管后，需要等待通气5s-10s，以置换瓶中空气，在抽出氮气流针头的同时塞紧异丁烯橡胶塞（操作要领：抽出针头时要注意，橡胶塞应该先半扣到瓶口，然后用右手食指揿住，左手捏住通气针头慢慢抽出针头，橡胶塞可能会外翻导致漏气等，此时将针头往瓶内伸，使塞子恢复原样，有时需要反复多次，视塞子大小而定，最后拔出针头，拔出同时立即将塞子塞进管口），最后旋紧盖子。

3.         121℃高压蒸汽灭菌20min。

（三）、专性厌氧菌液体培养基配制（以制备1000ml为例）

1、  按照配方配制培养基，定容后，加入1ml的1‰刃天青母液（W/V）(终浓度0.001‰)，0.4g的半胱氨酸（L-Cysteine）(终浓度0.4‰)，用NaOH或KOH调节pH值（resazurin和半胱氨酸对培养基的pH有影响，应加入后再测pH）。

2、  制备高纯氮气，操作过程同（一）；将厌氧管固定到铁架台的夹子上并通氮气，在培养基中加入5% Na₂S•9H₂O溶液，使其终浓度为0.5‰，用枪吸取适量培养基注入到厌氧管（或厌氧瓶中），通气10-20S，塞上橡胶塞，旋紧盖子。

3、  厌氧试管用牛皮筋扎成7支或者10支一捆即可灭菌，121℃湿热灭菌20min。

（四）厌氧菌固体培养基配制

1、  同（三）1。

3、  煮沸10分钟后，开始通高纯氮气；将厌氧管固定到铁架台的夹子上并通氮气，加入5% Na₂S•9H₂O溶液，使其终浓度为0.5‰。然后用10ml的定量注射针筒取5ml培养基注入15ml已换气的厌氧试管中。（注意：因为是固体培养基，注射器活塞处容易被琼脂粘住，使得封闭性较高，相对来说不易变红，但是也会有少许颜色，不用担心，同样加入少量硫化钠到管子或者瓶子内即可）。

（五）厌氧菌分离纯化

1、富集培养：用灭菌小铁锹铲取0.5g-2.5g样品至装有20-25ml培养基的厌氧瓶内，充N₂ ，塞紧塞子，然后振荡均匀，一定温度下静置培养。培养几天后进行稀释涂布，方法在“直接涂布法”中有详细介绍。

2、直接涂布法：

1）样品梯度稀释：取含9ml无氧无菌水的厌氧试管若干支，用无菌1ml定量注射器以10倍稀释法稀释污泥菌悬液至合适浓度（稀释度视样品生长情况而定, 要注意用1ml注射器与18#针头结合时，1ml注射器的量程已经不准确，经过移液枪的确定，0.7ml刻度处即相当于1ml）。由于没有经过富集所以样品中含有的菌量较少，直接涂布法中菌悬液的稀释度做到10^-2就可以了；而富集后的菌液为得到单菌落，稀释度一般要做到10^-6。

2）涂布：用无菌1ml定量注射器取相应稀释度的污泥菌悬液0.2ml于含4.5ml的固体培养基的厌氧试管中，立即滚管。滚管的要领是：注射器从梯度稀释液转移到滚管之内后，塞紧塞子，将稀释液均匀涂滚于厌氧管壁内，然后再取出塞子，通无氧高氮气体，用无菌注射器与无菌针头将多余的液体（包括了原来的冷凝水与稀释液）吸出来，可防止过多的水滞留导致滚管模糊、菌落不清。

3）培养：培养温度以及培养时间看菌的生长来定，有些只要两三天，长的需要十来天，这些可以查其他科技工作者所做的相关属菌株的条件来设定，一般如果条件合适，3天左右会有菌落长出。

（六）厌氧菌菌落的观察和纯化

1、观察 4d培养后，观察厌氧试管内壁上出现菌落；

2、纯化 多次涂布滚管，挑单菌落纯化，若在低稀释度下形成了单克隆菌落，那么可以认为其已经比较纯，也可以做鉴定工作，比如简单染色观察菌落形态是否一致等。

建议：

1.       将刃天青配成母液，母液浓度为1‰（W/V），4℃冰箱放置。

2、专性厌氧菌生长于很低的氧化还原电势下，其呼吸链末端电子受体为无机氧化物和有机氧化物的生物氧化，这是一类在无氧或低氧条件下进行的产能效率较低的呼吸形式。

3、刃天青的指示：刃天青在氧化态时呈紫绛色，在完全还原时为无色，它第一步不可逆地还原为Resorufin, 呈现桃红色，然后再可逆性地还原为无色的二氢Resorufin。如果制备的培养基呈现桃红色，表明培养基已经被氧化，氧还电位已升高。其还原指示电位为-42mv。